荧光染料选择和数据分析.
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1、荧光染料的选择及数据分析张新梅From BD Biosciences荧光染料的选择什么是流式细胞仪什么是流式细胞仪 在流动的状态中检测颗粒性物质各种物理及生物特征的一种仪器；Injector TipSheath fluid流式细胞仪原理 检测信号 散射光信号 前向散射光信号(FSC) 侧向散射光信号(SSC) 荧光信号流式细胞仪原理 散射光信号 当颗粒通过聚集的激光束时，激光向各个方向散射。与激光束方向同轴的称前向角散射光信号（FSC）。与激光束垂直的称为侧向角散色光信号（SSC）。流式细胞仪原理 前向角散射光信号（FSC） FSC反映细胞大小，一般来说，细胞越大，前向角散射光信号越强； FS
2、C信号与细胞的折射率有关； 可用于表示细胞的凋亡； 区分死/活细胞时，可用于设门；流式细胞仪原理 侧向角散射光信号（SSC） SSC信号主要反映了细胞的内部结构，内部结构越复杂，SSC信号越强；流式细胞仪原理 FSC和SSC信号用于检测并显示细胞的物理学特征中性粒细胞单核细胞淋巴细胞Side ScatterForward Scatter0200400600800100002004006008001000流式细胞仪原理 荧光信号 当荧光抗体或其他染料染色的颗粒通过激光束时，染料吸收光子跃迁到激发态，返回基态时，染料释放出能量，大部分以光的形式释放。这种发射出的光称为荧光。流式细胞仪原理流式细胞仪
3、原理流式细胞仪原理流式细胞仪特点及检测标本 特异性强，灵敏度高，速度快，并能实现多参数分析； 可检测的样本种类多样 (1)外周血，骨髓，细针穿刺，洗脱液，实体组织，培养细胞 (2) New!血清、血浆、培养上清、细胞裂解液 荧光染料选择的必要性 多色流式细胞仪的开发促进了新的荧光染料的发现及抗体标记物的发展 但抗体组合选择非常复杂，如果随意选择荧光素搭配的抗体，不可能得到合适的结果。 在荧光染料的选择上多一点考虑，就可避免重复实验和错误的结果。流式细胞仪原理 荧光信号激发波长荧光素发射波长了解你的仪器基本要求-了解你的仪器 试剂的选择从了解你的仪器的配置开始 激光（激发光源）：是否可以激发待选
4、的荧光素 检测器：是否有足够的检测器来检测所要用的荧光抗体组合 光路设计：影响特别染料的检测效率 滤片：宽滤片提高检测能力，但也会检测到更多干扰光荧光染料 488nm激光激发的染料荧光染料 633nm激光激发的染料(APC)荧光染料 UV激光激发的染料荧光染料 常见荧光染料的发射波长了解荧光素的性质了解荧光素的相对荧光强度 荧光素/单抗结合物的亮度 每种荧光素的相对荧光强度不同Cascade BlueAPC-Cy7FITCPE-Cy7Texas RedPEPE-Cy5APC02468100.280.951.01.42.84.66.29.2Relative BrightnessPositive
5、/ negativePositive / autofluorescenceCD8 fluorescence of CD3+ cellsData: Dr. Mario Roederer, Stanford Univ.了解荧光素的相对荧光强度 各种荧光素在BD LSRII流式细胞仪上的染色指数了解荧光素的相对荧光强度 每种荧光素的相对荧光强度不同 对一个既定的单抗来讲，因为结合的荧光素不同，阳性/阴性细胞的S/N比值可相差4-6倍FITCPECy-ChromeCy7-PETexasRedAPCPharRedCascade Blue110100110100Fluorescence Intensity
6、Relative Number of Cells110100110100Data: Dr. Mario Roederer; Stanford UniversityNeg ControlPositive (CD8-X)了解荧光素的相对荧光强度 每种荧光素的相对荧光强度不同 不同仪器的激光及滤片组合不同，荧光素的相对荧光强度也不同0.11101000.11101000.11101000.11101000.11101000.11101001000FITCPECy-ChromePerCPPharRedAPCVantage8922213620562104Calibur10935920915023927了
7、解荧光素的相对荧光强度 F/P比值 抗体上荧光素分子的多少（F/P）也会影响相对的荧光强度。 FITC和PerCP的结合物通常一个抗体分子上结合几个（2-9个，依抗体而定）荧光素分子。APC和PE与抗体结合一般是1：1。 复合染料PE-CY7和APC-CY7一般一个PE/APC分子结合多个CY7分子，一个PE/APC分子与抗体1：1结合 与之相反的是，复合染料PerCP-CY5.5，PerCP与CY5.5的比例是1：1 因为荧光素结合的化学因素的关系，IgM抗体一般与小分子的荧光素联结，如FITC、Texas-Red、CY3、CY5。复合荧光染料-Tandem dyeIsolated dono
8、rDonor distance too greatDonor distance correct复合荧光染料 被激发的Donor荧光素将能量转移给受者acceptor,需要满足条件: Donor的发射波长与acceptor的激发波长有重叠 Donor和Acceptor分子之间的距离不能太远(100A)复合荧光染料Fluorescence Resonance Energy TransferIntensityWavelengthAbsorbanceDONORAbsorbanceFluorescenceFluorescenceACCEPTORMolecule 1Molecule 2荧光染料 多色分析荧
