应用RT-PCR检测口蹄疫

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1、应用RT-PCR检测口蹄疫病毒（FMDV）1样品的采集1.1 水泡液和水泡皮：用一次性注射器抽取水泡液，用灼烧的止血钳封死注射器前端，放入保鲜盒，加冰贮存送检；将水泡皮剪下，放入干净青霉素瓶中，放入保鲜盒加冻贮存送检。1.2 组织脏器：如血液、淋巴结、肌肉等。取样后放入干净青霉素瓶或干净食袋中，于保鲜盒内加冰贮存送检。1.3 鼻咽拭子：用灭菌的棉签采集后，放保鲜袋中加冰贮存送检。2样品的处理：（在无菌室或超净工作台上进行）2.1 水泡皮、脏器等：取1-2g用无菌PBS缓冲液（0.04M,pH7.2-7.4）冲洗干净，剪碎、研磨，用PBS稀释成1:21:5的悬液置4冰箱过夜。8000rpm离心5

2、分钟，取上清液为检测材料。2.2 鼻咽拭子：加入2ml PBS缓冲液，充分挤压，取出棉签8000rpm离心5分钟，取上清液。2.3 血液、水泡液：血液可直接作检测材料；水泡液于8000rpm离心5分钟后取上清，若量太少可适当加入PBS缓冲液。3引物的设计与合成：根据GenBank发表的口蹄疫病毒（FMDV）核酸序列，设计出一对引物：P1、 P2。由上海生物工程公司合成。分别位于FMDV的VP1的上游和下游2A处。PCR产物大小约750bp。4主要仪器设备：高速台式离心机、PCR扩增仪、电泳仪、凝胶成像系统等。5RNA的提取： 常规法提取待检样品RNA（异硫氰酸胍法） 取300l待测样品上清液（

3、见5.1），加6M异硫氰酸胍变性液300l，混匀，冰浴10分钟，加2M醋酸钠（NaAc,pH4.0-4.5）60l（总体积的1/10），混匀，再加等体积的酚-氯仿-异戊醇（25:24:1），充分混匀后冰浴10分钟，8000rpm离心8-10分钟。取上层水相至另一1.5ml离心管中，加等体积异丙醇，-30 4小时以上或过夜。12000rpm离心10分钟。尽可能倒干液体留下沉淀（也许管中无肉眼可见物）。加800m75%乙醇，轻轻摇荡2-3次，12000rpm离心8分钟，倾去液体，风干或真空抽干，其沉淀可溶于30-50l水，用于RT-PCR或贮于-70备用。 可选用各种商品化的RNA提取试剂盒 以上

4、海生物工程公司生产的RNA提取试剂盒SK362为例：取待检材料上清200ul，于1.5ml离心管中，加700ul RLT溶液，涡旋混匀，再加500ul无水乙醇混匀；将分离柱UNIQ-10放入2ml收集管，并将1.5ml离心管中的溶液移入分离柱内，10000rpm离心1分钟，弃去过滤液，加500ul RW溶液于分离柱内，10000rpm离心1分钟弃去过滤液，加500ul RPE溶液于分离柱，10000rpm离心2分钟，取出分离柱，放入另一洁净1.5ml离心管中，加30-50ul DEPC处理水于分离柱中央的膜上，10000rpm离心1分钟，弃去分离柱，所得到的RNA直接用于RT-PCR反应或贮于

5、-70备用。6RT-PCR操作程序 可选用商品化的二步法或一步法RT-PCR试剂盒，以大连宝生物公司生产的一步法试剂盒为例，每支PCR管中含以下组份：模板RNA（由步骤5.1制备） 5-10µl10× RT-PCR缓冲液 5µl25mM MgCl2 10µl10mM dNTPs 5µlRNA酶抑制剂 1µl反转录酶（AMV Rtase XL） 1µlTaq聚合酶 1µl引物 各1µlDEPC处理水 15-20µl 总体积为50µl。根据PCR仪的要求，决定是否加矿物油（约20µ

6、;l）覆盖。 RT-PCR反应程序为：50反转录30分钟、94热变性3分钟进入循环，94 1分钟，56 1分钟，72 1分钟，35-40个循环后72延伸10分钟。 以本室构建的重组质粒pMDVP1为模板作为标准阳性对照。注意：1RNA提取和RT-PCR所用枪头、离心管、水等均需用0.1%DEPC（焦碳酸二乙酯）处理12小时以上，再经120高压灭菌30分钟（除去RNA酶）。2操作者需戴口罩及一次性塑料手套，以免唾液、汗液（含RNA酶）污染RNA样品。 7 RT-PCR产物的检测 各PCR产物取5-10l加样于1%琼脂糖TBE凝胶电泳，在紫外灯下观察各PCR产物在凝胶中的位置，以重组质粒pMDVP1的PCR产物作为阳性对照，2000bp DNA Mark作参照，判定结果。（华中农大 顾贫）