第3章细胞生物学研究方法-2016

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1、1细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法2 光学显微镜：以可见光（或紫外线）为光源。光学显微镜：以可见光（或紫外线）为光源。 电子显微镜：以电子束为光源。电子显微镜：以电子束为光源。肉眼：肉眼：0.2 mm; 光镜：光镜：0.2 m m; 电镜：电镜：0.2 nm31. 4（The Light Microscope）1) 1) 结构结构光学显微镜光学放光学放大系统大系统目镜目镜物镜物镜照明照明系统系统聚光镜聚光镜光源光源机械支持系统机械支持系统显微镜的分辨力由哪部分决定？显微镜的分辨力由哪部分决定？5分辨率分辨率 =0.61X0.5/1.4=0 63）总放大率：总放大率：74)4) 目镜的目镜的

2、 作用：作用： 与显微镜的分辨率无关，它只是把物象第与显微镜的分辨率无关，它只是把物象第二次放大，使眼睛便于观察。二次放大，使眼睛便于观察。 目镜只能将物镜已经分辨的影像进行放大，目镜只能将物镜已经分辨的影像进行放大，无法观察到未被物镜分辨的细节。无法观察到未被物镜分辨的细节。问题：使用问题：使用40/0.6540/0.65物镜时，应选配适宜目镜物镜时，应选配适宜目镜5 5）应用：经过固定染色后，切片标本的观察。）应用：经过固定染色后，切片标本的观察。8移动臂移动臂蜡或树脂包埋的样品蜡或树脂包埋的样品切片用钢刀切片用钢刀样品切片蜡带样品切片蜡带伸展在盖玻片和伸展在盖玻片和载玻片之间的切片载玻片

3、之间的切片切片机切片机石蜡切片石蜡切片固定剂（甲固定剂（甲醛）醛）乙醇脱水乙醇脱水-二甲苯二甲苯-石蜡包埋石蜡包埋9VWAp27 TUNEL 10染色细胞染色细胞未染色细胞未染色细胞光线通过染色的细胞，光线通过染色的细胞，振幅变低。光线通过振幅变低。光线通过未染色的细胞，振幅未染色的细胞，振幅不变，但相位发生改不变，但相位发生改变。变。利用光利用光衍射和干涉衍射和干涉特特性，通过添加物镜后性，通过添加物镜后焦面上焦面上相板相板和聚光镜和聚光镜上的上的环状光栅环状光栅，使相，使相位差变为振幅差，提位差变为振幅差，提高高明暗对比。明暗对比。11在构造上，相差显微镜在构造上，相差显微镜有不同于普通光

4、学显微有不同于普通光学显微镜两个特殊之处。镜两个特殊之处。环形光阑环形光阑（annular diaphragm）：位于光）：位于光源与聚光器之间。源与聚光器之间。相位板相位板（annular phaseplate）：物镜中）：物镜中加了涂有氟化镁的相位加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射板，可将直射光或衍射光的相位推迟光的相位推迟1/4。12Figure 3-2. Interference between light waves. When two light waves combine in phase, the amplitude of the resultant wave is la

5、rger and the brightness is increased. Two light waves that are out of phase partially cancel each other and produce a wave whose amplitude, and therefore brightness, is decreased. 13 衍射光的相位比直射光推迟衍射光的相位比直射光推迟1/4波长波长 明反差（负反差）明反差（负反差）：将：将直射光推迟直射光推迟1/4入入，使，使直射光和衍射光，维持同一相位，由于干涉现直射光和衍射光，维持同一相位，由于干涉现象，合成光的

6、振幅是二者象，合成光的振幅是二者振幅之和振幅之和，而背景只，而背景只有直射光，所以被检物体比背景亮。有直射光，所以被检物体比背景亮。 暗反差（正反差）暗反差（正反差）：将：将衍射光推迟衍射光推迟1/4入入，由，由于直射光和衍射光的干涉作用，合成光的振幅于直射光和衍射光的干涉作用，合成光的振幅是直射光与衍射光是直射光与衍射光的差的差，而背景只有直射光，而背景只有直射光，所以背检物体比背景暗。所以背检物体比背景暗。优点：可对未经染色的标本和活细胞进行显微内优点：可对未经染色的标本和活细胞进行显微内部结构的观察，提高分辨率部结构的观察，提高分辨率143. 3. 微分干涉差显微镜微分干涉差显微镜 （d

7、ifferential-interference microscopy）利用的是利用的是偏振光偏振光，这些光经棱镜折射后分成，这些光经棱镜折射后分成两束，在不同时间经过样品的相邻部位，然两束，在不同时间经过样品的相邻部位，然后在经过另一棱镜将这两束光汇合，从样品后在经过另一棱镜将这两束光汇合，从样品中厚度上的微小区别就会转化成明暗区别，中厚度上的微小区别就会转化成明暗区别，增加了增加了样品反差样品反差并且具有并且具有很强的立体感很强的立体感。一些较大的细胞器，如核、线粒体等，立体一些较大的细胞器，如核、线粒体等，立体感特别强，适合于显微操作，影像具有感特别强，适合于显微操作，影像具有浮雕浮雕感

8、。感。15丁达尔效应原理丁达尔效应原理分辨力：分辨力：0.004um利用特殊聚光器，使利用特殊聚光器，使照明光线照明光线不不能进入能进入物镜物镜，经过标本的，经过标本的散射光散射光进入物镜放大。进入物镜放大。观察样品结构的观察样品结构的明亮轮廓明亮轮廓，如，如活活细胞细胞内的细胞核、线粒体等，但内的细胞核、线粒体等，但分辨不清内部分辨不清内部结构结构。16 (A) 普通光学显微镜普通光学显微镜 (B) 相差显微镜相差显微镜 (C) 微分干涉差显微镜微分干涉差显微镜 (D)暗视野显微技术暗视野显微技术. 1718倒置：物镜在载物台之下，照明系统倒置：物镜在载物台之下，照明系统在在载物台载物台之上

9、，用于观察培养的之上，用于观察培养的活细胞活细胞，通常具有，通常具有相差相差物镜。物镜。19原理：原理：荧光物质荧光物质经经波长较短波长较短的光线照射后分子被的光线照射后分子被激活激活，吸收能量吸收能量后处于后处于激发态激发态释放能量，其能量一部释放能量，其能量一部分转化为热能，大部分能量则以波长较长的光分转化为热能，大部分能量则以波长较长的光能能荧光荧光形式辐射出来。形式辐射出来。应用：检测细胞上的特异荧光染料。应用：检测细胞上的特异荧光染料。20第一滤第一滤光片光片第二滤第二滤光片光片平面反射镜平面反射镜物镜物镜仪器：光源，仪器：光源，滤色装置滤色装置高高压压汞汞灯灯2122荧光标记物：荧

10、光标记物：异硫氰酸荧光素异硫氰酸荧光素(FITC), rhodamine.23多种荧光探针多种荧光探针着丝点着丝点:红色红色DNA：蓝色：蓝色纺锤体微管：绿色纺锤体微管：绿色DAPI即4,6-二脒基-2-苯基吲哚(4,6-diamidino-2-phenylindole) 24257. 激光扫描共聚焦显微镜激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope )26原理原理原理原理 激光光源通过一个微小激光光源通过一个微小缝隙，打到一个缝隙，打到一个二向色二向色镜镜。由镜子反射的光线。由镜子反射的光线通过通过物镜物镜、聚焦在样品、聚焦在样品的的一个层面上一

11、个层面上。样品被。样品被激发后发出较长波长的激发后发出较长波长的光，通过物镜成像、聚光，通过物镜成像、聚焦在显微镜中的一个焦在显微镜中的一个针针孔缝隙孔缝隙中，而来自中，而来自其它其它层面的光线被挡板挡住层面的光线被挡板挡住。图像通过信号放大传输图像通过信号放大传输到计算机中。到计算机中。 27特点：单色激光形成的点光源特点：单色激光形成的点光源光点扫描光点扫描二维图像二维图像改变焦平面改变焦平面三维重建处理三维重建处理优点：优点：使图像异常清晰，提高灵使图像异常清晰，提高灵敏度和分辨率敏度和分辨率28肠胚期果蝇胚胎细胞微丝的常规和肠胚期果蝇胚胎细胞微丝的常规和confocal荧光显微镜的图像