高效液相色谱2013
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1、高效液相色谱高效液相色谱High performance liquid chromatography, HPLCl 流动相流动相l 固定相固定相 基质、官能团基质、官能团基本内容HPLCHPLC液相色谱流程图液相色谱流程图PUMPDetectorW泵泵分离柱分离柱检测器检测器进样阀进样阀采用高压输液泵将具有不同极性的单一溶剂单一溶剂或不同比例的混合溶剂泵入色谱柱进行分离测定的色谱方法。适用对象：适用对象： 高沸点、热不稳定有机及生化样品高沸点、热不稳定有机及生化样品一、概 述分析对象分析对象流动相差别流动相差别GC能气化、热能气化、热稳定性好、且稳定性好、且沸点较低的样沸点较低的样品，占有机物
2、品，占有机物的的20%20%惰性气体惰性气体HPLCl不受样品挥不受样品挥发性和热稳定发性和热稳定性的限制，占性的限制，占有机物的有机物的80%80%l液体，种类液体，种类较多，选择余较多，选择余地广地广HPLCHPLC与与GCGC区别区别一、概 述HPLC&经典经典LC参数参数经典经典HPLC内径内径, cm1-5 0.4长度，长度，cm50-10015-30填料粒度，填料粒度，um150-2003-7操作压力操作压力, atm1-1050-200分离时间分离时间0.5h - day10LPRF84 三高三高 一广一广 一快一快由于液体与气体性质的以下差异：由于液体与气体性质的以下差
3、异： 液体中扩散系数比气体中小液体中扩散系数比气体中小105倍倍左右左右 液体粘度比气体约大液体粘度比气体约大102倍倍 液体密度比气体约大液体密度比气体约大103倍倍 液体不可压缩液体不可压缩二、影响分离的因素二、影响分离因素H = A + B/u + Cu 球形固定相，高压、匀浆装柱球形固定相，高压、匀浆装柱法法dp选粒径小的化学键合相选粒径小的化学键合相C 选粘度小、低流速的流动相选粘度小、低流速的流动相柱外效应又称柱外谱带扩展，是指色谱柱之外的造成色谱峰展宽的因素。是指从进样点到检测池之间除柱子本身以外的所有死空间。主要由进样装置、检测池及它们与柱之间的连接管路所产生,尽可能地减小柱外
4、效应也是HPLC仪器制造技术革新的不断追求实验表明进样阀引起的柱效增加效果非常显著,柱外死体积减小后柱效增加134倍、分离度提高116倍2柱外2进样+ 2连接管+ 2接头+ 2检测池+ 2其它中心进样池体积匹配柱外效应标志？l 反相色谱反相色谱l 正相色谱正相色谱l 亲水作用色谱亲水作用色谱l 离子色谱离子色谱l 排阻色谱排阻色谱HPLC分类n 分离机制：分配机理n 固定相：非极性键合相 C18、 C8n 流动相：极性流动相 如如: :甲醇甲醇- -水或乙腈水或乙腈- -水或四氢呋喃水水或四氢呋喃水n 样品极性与k的关系: 极性、保留时间n 应用范围：非极性-中等极性组分(80%)反相色谱反相
5、色谱 (RP-HPLC) 反相色谱反相色谱 RPLCRPLC固定液极性固定液极性 流动相极性流动相极性极性小的组分先出柱，极性大的组分极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱后出柱HPLC流动相选择原则 保持色谱柱的稳定性保持色谱柱的稳定性 化学惰性化学惰性 适合所用的检测器适合所用的检测器 对样品有一定的溶解能力对样品有一定的溶解能力 清洗、更换方便、毒性小清洗、更换方便、毒性小 沸点、沸点、粘度粘度等物理性质合适等物理性质合适采用采用 “HPLC” 级溶剂级溶剂细菌滋生 水的等级水的等级纯化水纯化水蒸馏水蒸馏水去离子水去离子水波长波长 (nm)纯化水纯化水去离子水去离子水因为不纯物的存在，去
6、离子的吸光率较高因为不纯物的存在，去离子的吸光率较高纯化水中去除了无机和有机的污染物纯化水中去除了无机和有机的污染物水水 / MeOH梯度梯度ODS 柱柱鬼峰鬼峰Gradient CurveHPLC级级优级纯优级纯分析纯分析纯都经过蒸馏和都经过蒸馏和0.45u的过滤的过滤(除纤维毛除纤维毛,未溶解的机械颗粒未溶解的机械颗粒优级纯的纯度比分析纯大优级纯的纯度比分析纯大,但里面含有防腐剂和抗氧化剂但里面含有防腐剂和抗氧化剂HPLC级经过级经过0.2m的过滤的过滤,且除去有紫外吸收的杂质且除去有紫外吸收的杂质甲醇甲醇 乙睛乙睛 正己正己烷烷分析纯级和 HPLC 级溶剂的吸光度比较图滤膜类型：l聚四氟
7、乙烯滤膜：适用于所有溶剂，酸和盐。l醋酸纤维滤膜：不适用于有机溶剂，特别适用于水基溶剂。l尼龙66滤膜：适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可以用于 强酸，不适用于二甲基甲酰胺。l再生纤维素滤膜：蛋白吸收低，同样适用于水溶性样品和 有机溶剂流动相的脱气流动相的脱气流动相脱气的目的1.使色谱泵的输液准确a.输液均匀准确，并且脉动减小b.保留时间及色谱峰面积的重现性提高2.提高检测的性能a.防止气泡引起的尖峰b.柱中气泡使流动相绕流，峰变形c.基线稳定，信噪比增加d.溶剂的紫外吸收本底降低3.保护色谱柱a.减少死体积b.防止填料的氧化除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡除去流动相中溶解或因混合而产生的
