染色体显带原理与技术

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1、染色体显带原理与技术染色体显带原理与技术肖文珺首都医科大学附属世纪坛医院检验科细胞分子遗传专业组一、染色体制备基础知识（一）细胞及细胞周期（二）从DNA到染色体（一）细胞周期及有丝分裂细胞：生物体结构和功能的基本单位，也是生命活动的基本单位。图略。细胞周期：指由细胞分裂结束到下一次细胞分裂结束所经历的过程。 G1期，指从有丝分裂期，指从有丝分裂完成到期完成到期DNA复制之前复制之前的间隙时间；的间隙时间；S期，指期，指DNA复制的时复制的时期；期；G2期，指期，指DNA复制完复制完成到有丝分裂开始之前的成到有丝分裂开始之前的一段时间；一段时间；M期，细胞分裂开始到期，细胞分裂开始到结束。结束。

2、 G0期：间期细胞，细胞期：间期细胞，细胞周期之外的细胞。周期之外的细胞。有丝分裂（二 ）从DNA到染色体DNA螺线管超螺线管超螺线管染色单体染色单体核小体核小体压缩7倍压缩40倍压缩6倍压缩5倍共计压缩8400倍核小体 nucleosome：染色质的基本结构DNA分子的不同存在形式：染色质和染色体v染色质：间期细胞核中遗传物质的存在形式。v染色体：分裂中期遗传物质的存在形式。一条染色体是一个DNA分子。染色质：根据在分裂期和间期的染色不同，分为v常染色质：在间期核中分布较稀疏，浅染色，是转录活跃的DNA部分，一般位于核中央。在分裂期，位于染色体臂，深染色。含大量功能基因。v异染色质：是呈凝集

3、状态的DNA与组蛋白的复合物，由于螺旋化程度高，又称为浓缩染色质，一般位于核内膜的边缘形成一薄圈，即称周围染色质。主要位于位于染色体的着丝粒、次缢痕、端粒等位置。间期和分裂期都深染色。基本无功能基因。基本概念v在细胞周期的有丝分裂中期，染色体的形态结构比较稳定，一般所描述的染色体的形态结构都是中期染色体。v染色体组型：又称核型Karyotype，是指将动物、植物、真菌等的某一个体或某一分类群（亚种、种、属等）的体细胞内的整套染色体，按它们相对恒定的特征排列起来的图像。v核型模式图Idiogram：是指将一个染色体组的全部染色体逐个按其特征绘制下来，再按长短、形态等特征排列起来的图像。二、染色体

4、显带技术Q带：喹丫因染色后，紫外照射下的明暗带（富含AT的明带，富含GC的暗带）；G带：Giemsa染料染色后所呈现的染色体区带；（AT区是深色）R带：是中期染色体经碱性磷酸盐处理，丫啶橙或Giemsa染色后所呈现的带型，一般与G带正好相反；C带：显示着丝粒结构异染色质及其它染色体区段的异染色质。T带：是染色体端粒部位经丫啶橙染色后呈现的区带；N带：Ag-As染色，主要染核仁组织者区域的酸性蛋白。 1975年建立了染色体高分辨显带技术。 几种显带的制作方法之间的关系G显带实验原理基础G显带：制备的染色体标本经胰蛋白酶消化、Giemsa染色后，可在染色体纵轴上显示出着色深、浅相间的横纹带，表明每

5、条染色体的特征。v只有可以分裂的活细胞，才能制备染色体。实验材料：实验材料：人外周血淋巴细胞，植物血凝素（PHA）刺激血中的淋巴细胞转化成淋巴母细胞，使其恢复增殖能力。v使用秋水仙素或者秋水仙碱破坏纺锤丝的形成，将细胞阻留在有丝分裂中期。从而获得大量的细胞中期分裂相供染色体分析。-采取少量外周静脉血，做短期培养，培养至72小时细胞进入增殖旺盛期，此时加入秋水仙素抑制细胞分裂，使细胞分裂停止在中期以获得足够量的分裂期细胞。v细胞低渗技术使细胞中的染色体在玻片上铺散得更好，易于计数和观察。v甲醇/冰醋酸固定液快速杀死和固定细胞。染色体检查过程（G显带）v培养细胞；v秋水仙素处理；抑制中期分裂相v低

6、渗；使细胞膨胀v固定；染色体形态固定v滴片；分散染色体。冰片法，熏蒸法。v显带和染色；v显微镜下分析。v实验步骤实验步骤v1. 采血及接种培养v1.1 采血：灭菌注射器抽取外周静脉血35ml(绿帽肝素抗凝管）v1.2 接种 在超净工作台中，注射器滴加25滴全血（6号针头）至外周血淋巴细胞培养液中（5ml，含植物血凝素60mg/ml、10%小牛血清），水平摇动混匀。置37恒温培养箱中培养6872小时。v1.3 终止培养前3540min，加入秋水仙素，使终浓度达到0.5g/ml。轻轻摇动培养瓶，使秋水仙素混匀。继续培养。v秋水仙素秋水仙素主要作用在于能阻滞微管(纺锤丝)形成，或使已形成的微管 解聚

7、，从而使染色体停留在中期。v秋水仙素浓度大，则处理时间短，如浓度小，则处理时间长。但若秋水仙素加入过量，或处理时间过长，分裂细胞多，染色体凝集和收缩变小，或发生异常分裂现象，甚至染色体破碎，不宜用于观察染色体的形态及计数；秋水仙素加入太少，或处理时间偏短，染色体形态偏长或无中期分裂相。v2制片v2.1收集细胞：将全部培养物吸入刻度离心管中，2000 rpm离心5分钟v2.2 低渗：弃上清液，加入37预温的 0.075 mol/L KCl溶液8 ml，用吸管轻轻吹打细胞团混匀后，置37恒温水浴箱低渗处理2025分钟。v2.3预固定：加入 1ml新配制的固定剂（甲醇：冰乙酸=3：1）或清质剂300

8、ul，用吸管小心吹打、混匀，2000rpm离心5分钟。v2.5 固定：v第一次：弃上清液，加入3ml固定剂，吹打细胞团制成细胞悬液后，室温下固定15分钟， 2000rpm离心5分钟。v第二次：弃上清液，重复固定一次。v第三次： 弃上清液，根据细胞数量的多少适当加入数滴新配制的固定剂，吹打细胞制成悬液。v2.6 滴片： 吸取少量细胞悬液，滴23滴于冰水浸泡过的载玻片上，吹散，水蒸气熏蒸，70 2小时烤片，待染色。v 3.G显带v3.1 取2.5胰酶溶液0.5ml，加入50 ml生理盐水染色缸中（终浓度0.025%），用 1N HCl或1N NaOH调节PH7.0左右，置 37OC预温。 v3.2

9、 将烤好的玻片标本放入胰酶溶液中处理60秒钟左右（胰酶消化时间需不断调试，摸索。不同时间配制，不同批号胰酶，以及随着处理标本数量增加，胰酶逐渐消耗，胰酶作用时间都会变化）v3.3 取出染色体玻片标本，置于37预温的生理盐水中，终止胰酶的作用。v3.4 将玻片标本放入37预温的1：10稀释的Giemsa染液中，染色510分钟。v3.5 自来水冲洗，自然晾干。G显带常见问题及处理：v培养细胞: 细菌污染。霉菌污染。细胞收获量小。玻片上细胞间期核稀疏。v秋水仙素：大量染色体太细长，缠成毛线团样。分裂相很多，但染色体短小，分叉。 几乎没有分裂相。v低渗：太分散。不分散。v固定：太发毛。背景不干净。有大

10、团块深染色物质。v滴片；不分散。太分散。v显带和染色；没有条带。条带模糊。一个分裂相内，有的染色体有条带，有的没有。有的胰蛋白酶消化太过，有的分裂相则不足。Giemsa染不上色。染色太深。染色太浅。各种组织标本的染色体制作不同的标本，不同的检查目的不同的标本，不同的检查目的，需要调整染色体的制作过程。处理原则：使尽可能多的细胞进入细胞周期，旺盛生长，大量分裂，防止污染。v外周血：5%小牛血清RPMI-1640，+PHA。检查体细胞核型。v骨髓：10 %小牛血清RPMI-1640，不含PHA。检查肿瘤细胞核型。v羊水：标本珍贵。专用羊水培养基，防止母体细胞污染。检查胎儿细胞核型。v绒毛组织：同上

11、。细胞为细胞团（组织），防止细菌污染。清洗、剪碎后消化成单细胞或者细胞团培养。检查胎儿核型。v脐带血：血液细胞，性质同外周血。一定注意防止母体污染！检查胎儿核型。v活检组织：如实体瘤标本。v细胞系：永生细胞。直接常规制作染色体标本即可。C显带 将染色体用碱或者去垢剂处理后，再用 Giemsa 染色，可以得到只显示着丝粒区域的带纹，称为称为 C带带。实验原理 C显带技术由Arrighi和Hsu于1971年发明，是显带技术中最简单的一种带型。其方法的本身是起源于原位杂交。Arrighi和Hsu发现用碱处理载玻片上的染色体使DNA变性之后，再在SSC溶液中、65的条件下使其复性，在受控制的条件下经G