微孔板检测技术的原理和应用
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1、微孔板检测技术的原理和应用张智彧张智彧 应用工程师应用工程师原理及应用介绍大纲 光的物理简介光的物理简介 光吸收检测的原理与应用实例 荧光检测的原理与应用实例 发光检测的原理与应用实例光的物理简介 光的本质 光的性质光的本质 一种能量 电磁波 电子能级（轨道） 波粒二相性 衍射 光电效应红外线光的性质 基本性质 速度：3108m/s 波长：颜色 频率：能量E = h 其他性质 偏振 荧光：激发c = 光的性质 物体的颜色 白光是复合光 单色光 互补色光 溶液的颜色 由溶液中的质点（分子，离子）吸收特定波长的光，透射其互补色的光 吸收曲线KMnO4溶液的吸收曲线(cKMnO4: abc200nm
2、） 光谱窄 发光时间长Elapsed TimeIntensity ExcitationAutoFluorescenceFluorescein Emission Europium Emission较长延迟时间较长延迟时间- Measurement -Eu:激发波长320nm，发射波长612/620nm时间分辨荧光（TRF） 和普通荧光相比，排除了背景光干扰 所有普通荧光强度（FI）检测，如干扰影响极大，无法排除，均可采用时间分辨荧光标记来解决以荧光为基础的检测技术 荧光强度(FI) 时间分辨荧光(TRF) 荧光偏振(FP) 荧光共振能量转移(FRET) 均相时间分辨荧光(HTRF)/(TR-FR
3、ET) 荧光寿命(FLT)用FI的方法检测分子间结合缺点：1、步骤繁琐，需要洗涤2、且每次洗涤强度很难一致，造成结果有差异，重复性差。优点：1、步骤简单，无需洗涤2、试验均一性，重复性好非均相试验孵育(结合)洗涤（去除非结合） 检测 均相试验孵育(结合)检测 荧光偏振（FP）的原理 光的偏振性PolarizerAnalyzerAnalyzerPolarizer荧光偏振（FP）的原理 如果荧光基团在处于激发态的时间内（如Fluorescein为4ns)保持静止，那么它发射出的荧光也是与激发光是同平面的polarized excitation100%0%stationary fluorophore
4、荧光偏振（FP）的原理 如果荧光基团在处于激发态的时间内是运动状态，那么它发射出的荧光会发生偏振平面的改变polarized excitation0%fluorophore in motion荧光偏振（FP）的原理 荧光偏振改变反映了分子的运动状态，也可以说反映了分子所处的环境的状态 分子运动快，偏振方向改变大 分子运动慢，偏振方向改变小 荧光偏振： 分子运动越快，P值越小 分子运动越慢，P值越大荧光偏振（FP）的原理 分子体积与运动速度的关系 体积越大，运动速度越慢 体积越小，运动速度越快 分子所处环境与运动速度的关系 溶液的粘稠度 利用荧光偏振的特性可以研究相互作用 分子结合，体积改变，运
5、动速度变化，P值相应发生变化 溶液状态变化，溶液的粘稠度改变，其中的分子运动速度变化，P值相应发生变化荧光偏振（FP）研究分子相互作用 原则 荧光基团标记在小分子上，偏振值低 当小分子与较大的分子结合后体积增加，偏振值增加 偏振值的大小反映了两个分子之间的结合效率与结合数量荧光偏振（FP）研究分子相互作用 配体受体结合 蛋白质与蛋白质结合 抗原抗体结合 蛋白质与DNA 的相互作用 DNA 杂交 酶活性检测 膜的流动性分析Estradiol与Estradiol Receptor ER：能和小分子疏水配体结合的核受体超家族成员，穿梭于胞浆和胞核内，具有转录因子的作用（DNA结合），包括ER、ER两
6、种亚型 Estradiol（雌激素）：与ER结合，引起其入核，调节基因转录 Estradiol类似物ER-竞争性结合物的筛选 雌激素受体ER-竞争性结合物可作为候选的药物成分 具体步骤 荧光标记的雌激素ES2与ER-结合，复合物较大，P值较大 加入竞争物之后，则能够将ES2替换下来，单独的ES2体积小，P值减小 P值的减小程度与竞争物的浓度的关系反映了竞争物的竞争性ER-竞争性结合物的筛选Estradiol-ER与DNA结合 ER核受体，Estradiol 与DNA结合，调节基因转录 传统方法EMSA 放射性，繁琐Estradiol-ER与DNA结合 荧光偏振方法 亲和层析纯化ER FAM标记
7、的DNA结合序列 偏振分析激酶活性分析 竞争性免疫分析检测激酶活性 被激酶磷酸化的产物与荧光标记的磷酸化示踪物竞争磷酸化抗体 荧光标记的磷酸化示踪物与抗体结合后荧光偏振值增加 激酶活性决定了磷酸化产物比例，荧光偏振值增加的程度与激酶活性成反比例 抑制物对激酶活性的影响激酶活性分析蛋白酶活性分析 蛋白酶将大分子的蛋白切割成小的片断，荧光偏振值变小 研究蛋白酶的动力学参数peptide fragmentsProteaseProtein偏振中数据处理问题 G值 仪器分别测量与激发光偏振平面平行和垂直的偏振光时，使用相同但是不是同一个光学元件 校准，使用已知偏振值的荧光物质及其相应的缓冲液计算G值。
8、P实际GP测量 G(RFUBUF )(1Pref)/(RFUBUF )(1Pref)偏振中数据处理问题 只有当被测样品的信号变化比对照组（正C+、负C- ）有足够的标准偏差，结果才有意义。偏振中数据处理问题荧光偏振优势 均相 (无分离/洗涤） 在溶液中进行，没有固相的参与，因此反应速度较快，操作也相应简单 测量的是比值，结果与荧光基团的绝对浓度/强度无关 无破坏性 (可重复测量) 无放射性 可实现高通量荧光偏振缺点 FP使用具有较短寿命的荧光素（如Fluorescein, TAMRA) ，它被限定为： 荧光标记的小的配体（如抗原）和大的受体（如抗体）的结合。 检测依赖于分子结合造成的分子体积的
9、显著改变。以荧光为基础的检测技术 荧光强度(FI) 时间分辨荧光(TRF) 荧光偏振(FP) 荧光共振能量转移(FRET) 均相时间分辨荧光(HTRF)/(TR-FRET) 荧光寿命(FLT)荧光共振能量转移（FRET） FRET：一对合适的荧光物质，前者的发射波长正好是后者的激发波长，当二者达到一定的分子距离时（19nm），供体发出的光子能量会传递给受体分子，受体被激发，发射荧光 供受体的激发光谱要分得足够开 供体的发射光谱要与受体的激发光谱重叠 供受体的发射光谱要分得足够开荧光共振能量转移（FRET） 荧光能量传递的效率与分子间的作用距离相关因此能量传递的发生及强度可以作为分子间发生相互作
10、用以及相互作用强弱的指示特征FRET的应用 分子间相互作用 药筛模型 蛋白质与核酸的结构和构象研究/蛋白质复合物的分配与组装 测量DNA寡聚体的结合（溶液中DNA杂交的动力学测量） 膜融合研究 分子内和分子间的距离测量 标记的大分子上特定位点的距离 测定供体和受体的距离，受体/配基相互作用激酶反应检测 FRET荧光素对标记底物分子 位点特异性的酶不能切开被激酶磷酸化的底物，保持FRET；磷酸化的底物失去FRET 测量Donor的发射光（445nm）和Acceptor的发射光（520nm），计算比值445/520。比值越大，激酶活性越强FRET的优势 均相检测 (无分离和洗涤步骤) 在溶液中进行
11、，没有固相的参与，因此反应速度较快，操作也相应简单 可以很好地观察活细胞内酶活性变化，并且能做到定时、定量、定位， 是一种非常有效的研究手段 无放射性FRET的缺点 供体与受体的距离限定为10-80，而许多生物结构（如蛋白-DNA复合物，大的蛋白，膜等）为80-130 信噪比经常不佳，通常为1：1；背景噪声来自供体荧光干扰及受体被直接激发 供体与受体浓度的比率很关键 必须有两种荧光标记以荧光为基础的检测技术 荧光强度(FI) 时间分辨荧光(TRF) 荧光偏振(FP) 荧光共振能量转移(FRET) 均相时间分辨荧光(HTRF)/(TR-FRET) 荧光寿命(FLT)均相时间分辨荧光(HTRF)/
