聚合酶链式反应原理.

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1、聚合酶链式反应技术Polymerase Chain Reaction 常立功2014-09-29-学术活动学术活动- PCR的起源与发展 PCR基本原理 普通PCR过程与分析 荧光定量PCR过程与分析-学术活动学术活动- PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。因此，无论是化石中的古生物、历史人物的残骸，还是几十年前凶杀案中凶手所遗留的毛发、皮肤或血液，只要能分离出一丁点的DNA，就能用PCR加以放大，进行比对。这也是“微量证据”的威力之所在。 DNA在复制时，其中两条以氢键结合的互补链必须先行分开，才能各自作为复制的模板；而打开双螺旋的最简单方法就是加热。在高温下，双股DNA链会分离成

2、单股，等温度降低后，互补的两条DNA链又可以恢复成双股。虽然DNA分子能耐高温，但进行DNA复制所需的聚合酶是蛋白质，在高温下会失去活性。这也是之前的研究人员不认为这种方法可行的原因之一。再有，要在千万条DNA当中，以一小段已知序列制成的引物，“钓”出所需的片段，进行复制，也跟大海捞针差不多，这是另一个让人却步的理由。 -学术活动学术活动- 1953年，DNA被发现是细胞里携带遗传信息的分子。 1956年，第一个细胞内用来复制DNA所需的聚合酶（此时的基因扩增仅在实验室，小规模的扩增，操作繁复，成本高）。 1973年，台湾人钱嘉韵在黄石公园里热泉中发现的嗜热菌中并分离出耐热的Taq聚合酶。 1

3、984年，美国人K. Mullis (穆里斯 )和日本人才木共同奠定了现代PCR技术的基础，使PCR技术进入普通实验室，前者在1993年获得诺贝尔化学奖 -学术活动学术活动- 现代实验室大多使用RT-PCR技术检测某个基因的表达。 逆转录（Reverse Transcription RT）是将RNA转录成cDNA的过程。 为什么要进行逆转录？ 为什么要提取RNA而非DNA？-学术活动学术活动- 逆转录示意图逆转录示意图-学术活动学术活动- 逆转录体系逆转录体系-学术活动学术活动- 1.Oligo(dT)18 ： 能与mRNA的Poly(A)尾巴可以发生特异性结合，适合真核生物mRNA的转录,尤

4、其是新鲜的组织或细胞，当所提取的RNA片段长度小于2kb,无复杂三级结构 随机六聚体引物：适用于mRNA内含抑制反转录酶活性的终止序列，适合提取无Poly(A)尾巴的RNA、石蜡和破碎组织内提取的RNA，特别是当提取片段超过2kb，内部有复杂的三级结构的， 特异性引物：用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。 逆转录引物区别逆转录引物区别-学术活动学术活动- 普通PCR反应体系反应体系5533d.NTPsTaq 酶Primers5353535353535353反应组分反应组分变变 性性535353535353 普通 PCR示意图示意图延延 伸伸53535353353TaqT

5、aq55重重 复复退退 火火5353535355335353循环循环2X2个拷贝个拷贝循环循环3X3个拷贝个拷贝53535353535353535353533553535353-学术活动学术活动-PCRPCR反应模式反应模式 -学术活动学术活动-普通普通PCRPCR结果分析结果分析 -学术活动学术活动-荧光定量荧光定量PCRPCR5533d.NTPsTaq酶Primers5353535353535353反应组分反应组分变变 性性535353535353荧光染料法原理荧光染料法原理SYBR Green ITaqIDlID延延 伸伸53535353检测激发的荧光检测激发的荧光535355TaqTa

6、q353TaqTaq55退退 火火IDIDIDIDIDIDIDIDIDIDlllll5533d.NTPsTaq酶Primers5353535353535353反应体系变 性535353535353Taql53RQProbe53RQTaqMan探针原理探针原理535353RQ退 火531. 链取代Taq3QR5533QTaqR52. 水 解3. 聚 合53QTaqR354. 检测荧光533QTaqR5l-学术活动学术活动- 标准曲线分析法荧光强度荧光强度-循环数曲线循环数曲线初始模板量对数初始模板量对数-C(T)循环数标准曲线循环数标准曲线10410310610510210-学术活动学术活动- 标准曲线分析法unknown104103-学术活动学术活动- 无需制备标准品(2 -c(t) 法法)，但需要内参照基因，且要求内参与目的基因扩增效率相近。 内参Ct值=15-14=1，21=2； 基因A: delta CT=20-18=2，22=4。 但是由于加样量是2倍，所以4/2=2，最后的相对 量是2倍 相对定量分析相对定量分析