第二章第四节干细胞工程(6)

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1、一个胚胎干细胞一个胚胎干细胞第四节干细胞工程第四节干细胞工程一、什么是干细胞？一、什么是干细胞？干细胞（干细胞（Stem cellStem cell）即起源细胞。在细胞的分化过）即起源细胞。在细胞的分化过程中，细胞往往由于高度化分而完全失去了再分裂的能程中，细胞往往由于高度化分而完全失去了再分裂的能力，最终衰老死亡。机体在发展适应过程中为了弥补这力，最终衰老死亡。机体在发展适应过程中为了弥补这一不足，保留了一部分未分化的原始细胞。一不足，保留了一部分未分化的原始细胞。因此，因此，干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。胞。全能细胞全能细胞囊胚囊胚囊胚内层

2、细胞团囊胚内层细胞团多能干细胞多能干细胞原始胚胎细胞原始胚胎细胞 受精受精 卵裂卵裂 受精后受精后72h 受精后受精后5-7天天精子精子+卵子卵子 合子合子 卵裂球卵裂球 桑椹胚桑椹胚 囊胚囊胚 滋养层滋养层胎盘及胎儿附属结构胎盘及胎儿附属结构囊胚囊胚 内胚层内胚层消化道、呼吸道上皮和腺体；肝；胆；胰。消化道、呼吸道上皮和腺体；肝；胆；胰。 内细胞群内细胞群 中胚层中胚层结缔组织；血液；肌肉；骨骼；泌尿生殖系统结缔组织；血液；肌肉；骨骼；泌尿生殖系统 外胚层外胚层体表结构；神经系统体表结构；神经系统它们是未分化的，但具有分化成各种特定细胞的能力；它们是未分化的，但具有分化成各种特定细胞的能力；

3、它们可无限地分裂产生大量后裔它们可无限地分裂产生大量后裔; ;其子细胞有两种命运，保持为干细胞或分化为特定细其子细胞有两种命运，保持为干细胞或分化为特定细胞。胞。干细胞的主要特征干细胞的主要特征： 全能干细胞全能干细胞 多能干细胞多能干细胞 单能干细胞单能干细胞按分化潜能按分化潜能按发育状态按发育状态胚胎干细胞胚胎干细胞成体干细胞成体干细胞干细胞的分类干细胞的分类全能干细胞全能干细胞： （Totipotent stem cell）具有形成完整个体的分化潜具有形成完整个体的分化潜能。如胚胎干细胞能。如胚胎干细胞（ES细胞细胞）多能干细胞多能干细胞：（pluripotent stem cell）具

4、有分化出多种细胞组织的具有分化出多种细胞组织的潜能。如造血干细胞、神经潜能。如造血干细胞、神经干细胞。干细胞。单能干细胞单能干细胞：（multipotent stem cell）只能向一种或两种密切相关只能向一种或两种密切相关的细胞类型分化。如上皮组的细胞类型分化。如上皮组织基底层的干细胞，肌肉中织基底层的干细胞，肌肉中的成肌细胞。的成肌细胞。胚胎干细胞 ES细胞是一种高度未分化细胞。它具有发育的全能性，能分化出成体动物的所有组织和器官，包括生殖细胞。 研究和利用ES细胞是当前生物工程领域的核心问题之一。在未来几年，ES细胞移植和其它先进生物技术的联合应用很可能在移植医学领域引发革命性进步。成

5、体干细胞 成年动物的许多组织和器官，比成年动物的许多组织和器官，比如表皮和造血系统，具有修复和再生如表皮和造血系统，具有修复和再生的能力。成体干细胞在其中起着关键的能力。成体干细胞在其中起着关键的作用。在特定条件下，成体干细胞的作用。在特定条件下，成体干细胞或者产生新的干细胞，或者按一定的或者产生新的干细胞，或者按一定的程序分化，形成新的功能细胞，从而程序分化，形成新的功能细胞，从而使组织和器官保持生长和衰退的动态使组织和器官保持生长和衰退的动态平衡。平衡。 二二 胚胎干细胞胚胎干细胞胚胚胎胎干干细细胞胞研研究究的的进进展展情情况况 1981 年年， Evans 和和 Martin 分分别别成

6、成功功的的分分离离和和体体外外培培养养了了小小鼠鼠的的胚胚胎胎干干细细胞胞 1995 年年，Thomson 等等人人分分离离建建立立了了第第一一株株灵灵长长类类动动物物的的胚胚胎胎干干细细胞胞。 1998 年年，Thomson 等等建建立立了了第第一一株株人人类类胚胚胎胎干干细细胞胞 1998 年年，Shamblott 等等建建立立了了第第一一株株人人类类生生殖殖干干细细胞胞 2000 年年，Reubinoff 等等建建立立了了两两株株人人胚胚胎胎干干细细胞胞。 1.衍生自囊胚的内细胞团或原始外胚层的细胞；衍生自囊胚的内细胞团或原始外胚层的细胞；2.永生化永生化(immortal)；3.能维持

7、稳定的正常的二倍体染色体结构；能维持稳定的正常的二倍体染色体结构；4.有稳定的发育潜能，能被诱导增殖或分化；有稳定的发育潜能，能被诱导增殖或分化；5.能参与胎儿所有组织的发育过程；能参与胎儿所有组织的发育过程；1 胚胎干细胞的性质胚胎干细胞的性质2.人类干细胞的来源 成人细胞或脐血成人细胞或脐血/ /胎儿组织胎儿组织( (专能专能/ /多能多能) )。 人工流产后的人类胎儿生殖组织人工流产后的人类胎儿生殖组织( (全能全能) )。 用捐赠者的配子通过体外授精创造的人类胚胎用捐赠者的配子通过体外授精创造的人类胚胎( (全能全能) )。 通过体细胞核转移技术通过体细胞核转移技术( (克隆技术克隆技

8、术) )产生的人类产生的人类胚胎胚胎( (全能全能) )。 以上都必须获得当事人的知情同意。以上都必须获得当事人的知情同意。 分离囊胚的内细胞群 与成纤维细胞共培养，ES 细胞非分化增殖 分离胚胎生殖腺脊细胞 -胚胎干细胞的鉴定-定向诱导分化-成体干细胞-功能细胞 3 胚胎干细胞系的建立过程胚胎干细胞系的建立过程胚胎干细胞的培胚胎干细胞的培养养4 培养条件：培养条件：(1)特殊的培养液特殊的培养液：胎牛血清的浓度和质量很重：胎牛血清的浓度和质量很重要，还要加非必须氨基酸；要，还要加非必须氨基酸；-巯基乙醇。巯基乙醇。(2) 以人或胚鼠的以人或胚鼠的成纤维细胞成纤维细胞为饲养细胞。为饲养细胞。(

9、3) 必须加入必须加入LIF(白血病抑制因子白血病抑制因子)，抑制细胞分，抑制细胞分化。化。干细胞的分化干细胞的分化干细胞培养过程干细胞培养过程5 干细胞诱导分化的常用方法干细胞诱导分化的常用方法（1）加入诱导细胞分化的因子或化学物质，）加入诱导细胞分化的因子或化学物质， 如如DMSO和和RA等等（2）将）将ES细胞与特定的细胞共培养细胞与特定的细胞共培养 （3）将某种分化诱导因子的基因转入）将某种分化诱导因子的基因转入ES细细 胞内胞内 胚胎干细胞的诱导分化胚胎干细胞的诱导分化： 胎牛血清，骨髓基质细胞共培养胎牛血清，骨髓基质细胞共培养胚胎干细胞胚胎干细胞造血细胞造血细胞 RA胚胎干细胞胚胎

10、干细胞神经细胞神经细胞 DMSO胚胎干细胞胚胎干细胞肌肉细胞肌肉细胞 TGF-B1, bFGF胚胎干细胞胚胎干细胞血管和内皮细胞血管和内皮细胞 RA+胰岛素胰岛素+T3胚胎干细胞胚胎干细胞脂肪细胞脂肪细胞 BMP-2, BMP-4胚胎干细胞胚胎干细胞软骨细胞软骨细胞 地塞米松，磷酸甘油地塞米松，磷酸甘油胚胎干细胞胚胎干细胞骨细胞骨细胞 基因转染基因转染胚胎干细胞胚胎干细胞胰岛素分泌细胞胰岛素分泌细胞6 胚胎干细胞的鉴别胚胎干细胞的鉴别 胚胎干细胞具有以下特点：胚胎干细胞具有以下特点：(1) 细胞内碱性磷酸酶活性高细胞内碱性磷酸酶活性高(2) 端粒酶活性高端粒酶活性高(3)细胞膜表面有特殊的标记

11、：细胞膜表面有特殊的标记：SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81(4)能分化成三个胚层的细胞，能分化成三个胚层的细胞，(5)将胚胎干细胞植入免疫缺陷小鼠皮下可产生畸胎瘤将胚胎干细胞植入免疫缺陷小鼠皮下可产生畸胎瘤(6) 可诱导分化为各种成体干细胞可诱导分化为各种成体干细胞7 胚胎干细胞的胚胎干细胞的 胚胎干细胞 生殖干细胞 SSEA-1 SSEA-3 SEA-4 TRA-1-60 TRA-1-81 AKP Oct-4 未知 端粒酶活性 滋养细胞 滋养细胞 无血清培养 bFGF 鉴定干细胞的常用方法：鉴定干细胞的常用方法：（1）细胞形态与结构）细胞形态与结构（2）细