第三章 层析技术

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1、第三章第三章 层析技术层析技术Chromatography作作 者：王者：王 英英联系电话联系电话：13907593478一、概一、概 述述 层层析析（Chromatography）又称为又称为色色谱谱, ,它利用它利用混合物混合物中中各组分各组分的的物理、化物理、化学性质学性质间的间的差异差异( (溶解度、分子极性、溶解度、分子极性、分子大小、分子形状、吸附力、分子亲分子大小、分子形状、吸附力、分子亲和力等和力等) ) ，使，使各组分各组分在在支持物支持物上集中上集中分分布在不同区域布在不同区域，借此，借此将各组分分离将各组分分离。 1、分配系数、分配系数(Partition chromat

2、ography) 混合物混合物在在层析层析过程中不管层析技术采过程中不管层析技术采用的用的流动相流动相和和固定相固定相是哪种状态都要达到是哪种状态都要达到分配平衡分配平衡。叙述一种物质在两种特定的相。叙述一种物质在两种特定的相中的分配程度用中的分配程度用分配系数分配系数（K）来表示。在）来表示。在特定温度特定温度时这个系数是一个时这个系数是一个常数常数。溶质在固定相中的浓度溶质在固定相中的浓度Cs K= = 溶质在流动相中的浓度溶质在流动相中的浓度 Cm 从一个混合物中从一个混合物中分离分离、纯化样品的纯、纯化样品的纯度如何，取决于混合物中各组分度如何，取决于混合物中各组分K值的差异值的差异程

3、度。程度。 混合物混合物中各组分若中各组分若 K值相差较大值相差较大, 则则较较易易把混合物中的各把混合物中的各样品样品分离分离。反之。反之,K值相值相差较小差较小,则则不易分离不易分离。 2、塔板理论塔板理论 在层析在层析分析过程分析过程把把层析柱层析柱划分划分(想象想象)为为若干个若干个连续部分连续部分,每个部分称为一个每个部分称为一个塔板塔板。 理论板数理论板数(n)：在层析柱上，溶剂连续不：在层析柱上，溶剂连续不断加入，化合物在流动相和固定相中不断断加入，化合物在流动相和固定相中不断分分配平衡配平衡，所发生的，所发生的平衡次数平衡次数称为称为理论板理论板数数。色谱历史色谱历史古罗马人分

4、析混合染料（类似辐射纸色谱）古罗马人分析混合染料（类似辐射纸色谱）1903年，年，Michael Tswett提出色谱法提出色谱法1931年，年，Kuhn采用柱色谱分离了类胡萝卜素采用柱色谱分离了类胡萝卜素1941年，年，Martin和和Synge提出分配色谱法提出分配色谱法 1944年，年，Martin等又提出纸色谱法等又提出纸色谱法 1952年，年，Martin和和James发明了气液色谱法发明了气液色谱法1955年，第一台商品气相色谱问世，标志着现年，第一台商品气相色谱问世，标志着现代色谱分析的建立代色谱分析的建立1956年，年，Stahl系统研究了薄层色谱法系统研究了薄层色谱法(TLC

5、)1958年，年，Stein和和Moore研制出氨基酸分析仪，研制出氨基酸分析仪，确定了核糖核酸的分子结构确定了核糖核酸的分子结构1967年，年，Horvvath和和Huber等研制了高效液等研制了高效液相 色 谱相 色 谱 ( h i g h - p e r f o r m a n c e l i q u i d chromatography,HPLC)仪仪1975年，年，Small等提出离子色谱等提出离子色谱 20世纪世纪80年代，超临界色谱年代，超临界色谱20世纪世纪90年代，毛细管电泳（年代，毛细管电泳（1809年年Ress第一次电泳实验）第一次电泳实验）21世纪，联用技术、大分子色谱

6、分离、制备世纪，联用技术、大分子色谱分离、制备色谱可望取得更大的发展色谱可望取得更大的发展 层析法层析法进行时有进行时有两个相两个相组成，一组成，一个为个为固定相固定相(Stationary phase )，另一个，另一个为为流动相流动相(Mobile phase )。由于。由于各组分各组分所受的在所受的在固定相的阻力固定相的阻力和和流动相的推流动相的推力力影响影响不同不同，各组分，各组分移动速度移动速度也也各异各异，从而从而使各组分得到分离使各组分得到分离。二、层析的一般原理二、层析的一般原理三、层析技术的分类三、层析技术的分类 ( (一一) )按两相所处的按两相所处的物态物态分类分类 以以

7、液体液体作为作为流动相流动相的称为的称为液相层析液相层析 以以气体气体作为作为流动相流动相的称为的称为气相层析气相层析 其其固定相固定相也可有也可有两种状态两种状态: 以以固体固体作为作为吸附剂吸附剂的固定相的固定相 以以涂布涂布在在固体表面固体表面的的液体液体作为固定相作为固定相（二）按固定相形式分类（二）按固定相形式分类 1、柱层析、柱层析（colum chromatography） 将固定相装在层析柱中将固定相装在层析柱中 2、纸层析纸层析（paper chrmatography） 纸作为固定相纸作为固定相 3、薄层层析薄层层析（thinlayperchromatography） 将吸附

8、剂在玻璃板或其他材料薄板上铺成将吸附剂在玻璃板或其他材料薄板上铺成薄层作为固定相薄层作为固定相（三）按层析过程的机制可分类（三）按层析过程的机制可分类 1、吸附层析、吸附层析(adsorption chromatography ) 利用不同组分利用不同组分吸附能力吸附能力的不同进行分离的不同进行分离 2、分配层析、分配层析(partition chromatography ) 利用不同组利用不同组分配系数分配系数不同进行分离不同进行分离 3、离子交换层析、离子交换层析（ion-exchange chromatography ） 利用离子交换剂与各组分之间的利用离子交换剂与各组分之间的静电力静电

9、力不同不同 4、凝胶层析、凝胶层析（gel chromatography） 利用不同组分之间利用不同组分之间分子大小分子大小不同进行分离不同进行分离 5、亲和层析、亲和层析（affinity chromatography） 利用生物大分子之间利用生物大分子之间特有亲和力特有亲和力的不同进行分离的不同进行分离 第一节第一节 凝凝 胶胶 层层 析析 Gel Chromatography一、概一、概 念：念： 凝胶层析凝胶层析：按照被分离：按照被分离物质分子大小物质分子大小,经经过具有一定孔径的过具有一定孔径的多孔凝胶物质多孔凝胶物质进行分离的进行分离的一种方法。又称为一种方法。又称为凝胶过滤凝胶过

10、滤或或分子筛过滤分子筛过滤或或排阻层析排阻层析。 主要机理是主要机理是分子筛效应分子筛效应,当被分离当被分离物质物质流流经经凝胶柱凝胶柱时时,因各组份的因各组份的分子大小不同分子大小不同,在凝胶在凝胶受到的受到的阻滞阻滞作用作用有差异有差异,从而造成各组分在从而造成各组分在凝凝胶柱胶柱中的中的迁移速度不同迁移速度不同得到分离。得到分离。 将将样品样品加入凝胶柱后加入凝胶柱后,分子大分子大的组份的组份不能不能进入凝胶中进入凝胶中被排阻在外被排阻在外,而而分子的小能通过孔分子的小能通过孔隙进入凝胶中隙进入凝胶中。加入。加入洗脱剂洗脱剂后后,大分子大分子就随洗就随洗脱剂从脱剂从凝胶颗粒间隙凝胶颗粒间

11、隙洗脱下来洗脱下来,其其流程短流速流程短流速快快,而而小分子小分子物质从物质从上一层凝胶孔隙中出来又上一层凝胶孔隙中出来又扩散到下一层凝胶孔隙中扩散到下一层凝胶孔隙中,这样多次反复这样多次反复即即流流程长程长,故大分子物质先从柱中流出故大分子物质先从柱中流出,小分子物质小分子物质后流出而得到分离。后流出而得到分离。二、基本原理二、基本原理 大分子大分子不能进不能进入凝胶孔隙中入凝胶孔隙中,被排被排阻在外阻在外,受到受到阻力小阻力小,流程短流程短，流速快流速快，先先从柱中流出。从柱中流出。 小分子小分子进入凝进入凝胶孔隙中胶孔隙中,阻力大阻力大，流程长流程长，流速慢流速慢，后后从中柱流出从中柱流