核桃蛋白水解制降压肽
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1、 1前言1.1研究目的和意义高血压是一种常见的心脑血管疾病，会引起心血管、大脑、肾脏的病变1。降压肽是一种ACE抑制剂，通常用于高血压患者的治疗2。目前，对高血压患者的治疗通常使用化学合成的药物，然而，这些合成药物有一些副作用,包括咳嗽和皮疹3。食源性降压肽来源于天然植物，无副作用，易被人体吸收4。不同的植物来源，降压功效作用也是不同的。核桃 (核桃) 蛋白质的具有广阔应用前景的新产品和强化身体的好来源5。核桃粕是核桃经过提取油后的副产物，含有29.65%蛋白质，提油后的核桃粕多数被用作饲料，资源造成了一定的浪费，酶解核桃粕蛋白制备降压肽可以促进核桃粕的深加工，实现资源的综
2、合利用。本文采用两种不同的蛋白酶共同作用水解蛋白，采用双酶复合水解可以增加蛋白酶的特异性催化位点6，可以提高可溶性蛋白含量及功能性多肽的产量和转化率7，并且增大了蛋白的水解度，也一定程度上增大了蛋白原料对肽的转化率，进而可以改善蛋白质水解液中功能性多肽的特性。本实验将两种蛋白酶分两步进行酶解，全面研究双酶分步酶解工艺制备核桃粕降压活性肽的工艺及参数，然后用响应面法对其工艺进行优化。1.2降压肽的研究进展日本是对食源性降血压肽研究最多的国家，且已经有此类降血压肽的商品上市，以其天然无毒的特性受到了广大消费者的信赖，而我国在此项的研究才刚刚起步8，目前临床上的高血压的药物治疗尽管有效可是也存在弊端
3、，如降压过度、泌尿系统发生病变、持续性咳嗽、味觉失真和血管神经性水肿等，而通过蛋白酶的水解获得的具有降血压活性的多肽不仅可以对高血压患者起到降血压的作用，对身体体质没什么影响，适合患者长期服用。随着国民生活水平的提高，人们的自我保健意识和安全意识也在逐渐加强，这种降血压肽会逐渐被人们接受，成为预防，缓解和治疗高血压的一个有效手段。2 材料与方法2.1 材料和设备核桃粕，康福寿核桃油加工有限公司；2709碱性蛋白酶(Alcalase)购于北京博奥拓达科技有限公司；风味蛋白酶购于sigma公司；FAPGG，呋喃丙烯酰三肽，购于sigma公司；ACE，血管紧张素转换酶，购于sigma公司；正己烷、盐
4、酸、浓硫酸、氢氧化钠等均为分析纯。试验用水均为去离子水。快速恒温数显水浴锅 金坛市医疗仪器厂；PHS-3 C雷磁pH计 上海精科；BS 2000 S电子天平 北京赛多利斯科学仪器有限公司；FDU-1200冷冻干燥机 北京四环科学仪器厂；ELx 808酶标仪 Thermo公司；SH 21-1磁力搅拌器 上海梅颖浦仪表制造有限公司；DNP-9272电热恒温培养箱 上海精宏实验设备有限公司。2.2 工艺流程低温脱脂核桃粕过60目筛脱脂提取核桃蛋白碱性蛋白酶和风味蛋白酶联合酶解条件的优化核桃ACE抑制肽2.3 核桃脱脂粉的制备核桃粕经粉碎后过60目筛，用正己烷以1:5(w/v)的料液比在磁力搅拌器上提
5、取1h后进行抽滤，取滤渣重复用正己烷提取至滤液无色透明时收集滤渣，然后用恒温干燥箱烘干溶剂，置于冰箱4冷藏备用。2.4 核桃蛋白的提取采用碱溶酸沉法提取核桃蛋白。参照毛晓英9的方法，略改。以购买的核桃脱脂粕为原料，将其烘干后粉碎，然后通过95%醇洗(1:10,(w/v)，过滤，把滤饼置恒温干燥箱烘干溶剂。然后用去离子水配制蛋白质溶液(1:26,(w/v)，调节蛋白液的pH值到11.0，置磁力搅拌器上53搅拌1.5h后7000r/min 25离心15min，取上清液，调节pH至4.5，搅拌1h，7000r/min 25离心15min，水洗沉淀，调节pH至中性后冻干，置于冰箱4冷藏备用。2.5 水
6、解蛋白酶的筛选表1 四种商业酶最适作用条件和酶活力Table 1 The optimum hydrolysis conditions and the enzymatic activity of four commercial enzymes酶种类最适pH最适温度()酶活力(U/g)碱性蛋白酶8.5557.1×104中性蛋白酶7.0406.3×105风味蛋白酶6.5502.0×104木瓜蛋白酶6.8558.2×105将上述的四种蛋白酶在各自的最适酶解条件下对核桃蛋白进行酶解，以ACE抑制率和水解度为指标，选出制备核桃降压肽的最适用酶，结果见图2：图1 四种
7、酶解液的ACE抑制率及其水解度的比较Fig.1 Comparison the four kind of enzyme solution on ACE inhibition rate and Hydrolysis degree由图1可以得到，不同蛋白酶对核桃粕蛋白的水解能力存在明显差异，其中水解液的ACE抑制率和水解度相对较高的是碱性蛋白酶和风味蛋白酶。ACE抑制肽构效关系研究表明，强ACE抑制活性肽的C-端氨基酸倾向于疏水性氨基酸。研究报道表明，核桃脱脂粉和核桃蛋白分离组分的氨基酸组成中，以谷氨酸、精氨酸、天冬氨酸含量较高，且主要以酸性氨基酸和疏水性氨基酸为主9。研究结果表明，对核桃蛋白的水解
8、能力碱性蛋白酶明显高于风味蛋白酶、风味蛋白酶高于中性蛋白酶和木瓜白酶，说明核桃蛋白的结构中存在较多的碱性蛋白酶和风味蛋白酶的作用位点，从而更有利于ACE抑制肽的释放。这与杨越10以葵花籽为原料酶法制备ACE抑制肽报道的结果比较相似。综合考虑选择碱性蛋白酶和风味蛋白酶为最适酶。2.6 实验方法表2.碱性蛋白酶和风味蛋白酶的最佳酶解工艺参数比较Table2.The optimum technology of Alcalase and Flavourzyme碱性蛋白酶风味蛋白酶酶解pH8.56.5酶解温度（）5550底物浓度（g/mL）3015酶解时间（h）23酶添加量（U/g）70006000分别
9、将碱性蛋白酶和风味蛋白酶在各自最佳工艺条件下进行酶解核桃蛋白，同时进行碱性蛋白酶和风味蛋白酶的分步酶解试验，具体操作如下：称取一定量的核桃蛋白，加去离子水配制成一定浓度的水解底物于水浴锅中90 10min处理后，在碱性蛋白酶的最佳反应条件下（即温度为55，pH8.5）加入碱性蛋白酶，随着反应的进行，酶解液的pH逐渐下降，滴加0.1mol/L的NaOH溶液以维持pH不变，分别间隔一定时间记录消耗的NaOH量，碱性蛋白酶酶解结束后无需灭酶11。将水解温度和pH调节至风味蛋白酶的最佳条件（即温度为50，pH6.5），用同样的方法保持系统的pH不变，同时间隔一定时间记录消耗的NaOH量。酶解结束后酶解
10、液立即于90沸水中灭酶10min，8000r/min离心15min取上清液进行水解度和ACE抑制率测定。2.7 核桃降压肽制备的单因素研究以核桃降压肽的ACE抑制率和水解度为指标分别考察双酶复配配比、底物质量浓度(g/L)、酶添加量(U/g)、三个因素对核桃降压肽制备的影响，进行单因素实验。2.7.1 底物浓度对酶解液ACE抑制率和水解度影响2.8 核桃降压肽制备的响应面实验设计在单因素研究的基础上，以双酶复配配比、底物质量浓度(g/L)和酶添加量(U/g)三个因素为自变量，以ACE抑制率为响应值，设计响应面分析实验。因素水平及编码表见表3。表3因素水平及编码表Table1.The table
11、 of factors and level编码水平A底物浓度B双酶复配配比C加酶量g/LU/UU/g-1202:150000301:160001401:270002.9 检测指标 2.9.1 水解度的测定采用 pH-Stat法12。2.9.2 ACE抑制率的测定在96孔酶标板上按表3设计添加反应物开始反应，在340nm波长条件下，用酶标仪测吸光值A1。使其在37的恒温培养条件下反应30min，测量吸光度A2，作3组平行试验13。ACE抑制率的计算公式如下：式中：Ab为加入缓冲基质时吸光度在 30min内的变化；Aa为加入抑制剂时吸光度在30min内的变化。表4 ACE抑制活性的测定Table
