高效液相色谱

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1、第三章第三章 高效液相色谱分析高效液相色谱分析High performance liquid chromatography第一节第一节 概概 述述 GC只适合分析只适合分析较易挥发、且化学性质稳定较易挥发、且化学性质稳定的有机化合物，而的有机化合物，而HPLC则适合于分析那些用则适合于分析那些用GC难以分析的物质。难以分析的物质。 所以，所以，HPLC的应用范围远远超过的应用范围远远超过GC。 高效液相色谱法是继气相色谱之后，高效液相色谱法是继气相色谱之后，20世纪世纪70年代初期发展起来的一种以液体做流动相的新年代初期发展起来的一种以液体做流动相的新色谱技术。色谱技术。高效液相色谱法定义高效

2、液相色谱法定义 特指一种用液体为流动相的色谱分离分析方法。特指一种用液体为流动相的色谱分离分析方法。它在经典色谱理论的基础上，采用了它在经典色谱理论的基础上，采用了高压泵高压泵、化学化学键合固定相高效分离柱、高灵敏专用检测器键合固定相高效分离柱、高灵敏专用检测器等新实等新实验技术建立的一种液相色谱分析法。验技术建立的一种液相色谱分析法。 高压：高压：150-350105 Pa 高效：大于高效：大于3万塔板万塔板/米米（GC：103塔板塔板/米）米） 高灵敏：高灵敏：10-9g （紫外检测）、（紫外检测）、10-11g （荧光检测）（荧光检测）高效液相色谱法与经典液相色谱法的比较高效液相色谱法与

3、经典液相色谱法的比较 经典液相色谱法经典液相色谱法高效液相色谱法高效液相色谱法粒径粒径(m)75-6003-50（常用（常用5-10）柱前压力柱前压力(atm)0.01-1.020-300分析时间分析时间 (h)1-200.05-1.0色谱柱长度色谱柱长度(cm)50-2002-30柱效柱效(块块/m)2-50104-105样品用量样品用量(g)1-1010-6-10-2经典液相色谱法，流动相在经典液相色谱法，流动相在常压常压下输送，下输送，分析周期长。分析周期长。而高效液相色谱法流动相改为而高效液相色谱法流动相改为高压高压输送输送（最高输送压力可达（最高输送压力可达3.5 107Pa） 色谱

4、柱是用色谱柱是用小粒径小粒径的填料填充而成，从而使的填料填充而成，从而使柱柱效效大大高于经典液相色谱；大大高于经典液相色谱； 柱后连有柱后连有高灵敏度的检测器高灵敏度的检测器，可对流出物进行，可对流出物进行连续检测。连续检测。 因此，高效液相色谱具有分析速度快、分离效因此，高效液相色谱具有分析速度快、分离效能高、自动化等特点。能高、自动化等特点。 所以称它为所以称它为高压、高速、高效高压、高速、高效液相色谱法。液相色谱法。HPLC在药物分析中的作用 药品质量标准在药物分析中，HPLC已成为对各类药物及其制剂进行鉴别、检查、杂质分离及含量测定的重要手段，以下以中国药典和美国药典为代表说明HPLC

5、在药品质量标准中的作用。中国药典含量主要测定方法统计/ %版本滴定分析法质量分析法分光光度法HPLCGC1953年版68.811.90001963年版68.211.36.93001977年版61.83.8922.3001985年版57.82.6428.01.170.291990年版52.12.2926.36.090.441995年版51.81.4228.98.010.572000年版47.61.228.017.80.6美国药典含量测定方法比较 （品种数）版本HPLCGCTLCUVIRFLAASNMRTI20版62682546921107221版363142698131727222版871157

6、15542171776578423版1188100449015578280324版138611113741414962775Atomic Absorption Spectroscopy 原子吸收光谱Nuclear Magnetic Resonance 核磁共振Infrared ray 红外光谱Fluorescence spectrum 荧光光谱TI 滴定分析法 药物分析研究方法药物分析研究方法 以我国分析试验室杂志中的药物分析综述统计分析见表19922000年分析试验室杂志药物分析论文统计 / %方法19921994199619982000UV27.727.128.517.616.2HPLC2

7、7.029.239.244.540.0GC12.810.37.69.78.0TLC13.416.612.216.121.4HPCE3.25.6电化学8.54.72.5其他10.611.410.09.08.8论文总数553923760870879HPCE 高效毛细管电泳法高效毛细管电泳法高效液相色谱法与其他分离方法的比较高效液相色谱法与其他分离方法的比较项目分馏结晶提取经典柱色谱TLCGCHPLC分离效率低低低低高高高分离速度慢慢慢慢较快快快应用范围窄窄广广广较窄广样品用量多多多多少少少可否用于制备可可可可尚可可可可否用于痕量分析否否否否可可可分析鉴定可可否否可可可分析灵敏度低低-高高高 应用应

8、用 由于由于HPLC分离分析的高灵敏度、定量的准确分离分析的高灵敏度、定量的准确性、适于非挥发性和热不稳定组分的分析，性、适于非挥发性和热不稳定组分的分析， 因此，在工业、科学研究，尤其是在生物学因此，在工业、科学研究，尤其是在生物学和医学等方面应用极为广泛。和医学等方面应用极为广泛。 如氨基酸、蛋白质、核酸、烃、碳水化合物如氨基酸、蛋白质、核酸、烃、碳水化合物、药品、多糖、高聚物、农药、抗生素、胆固、药品、多糖、高聚物、农药、抗生素、胆固醇、金属有机物等分析。醇、金属有机物等分析。第二节第二节 影响色谱峰扩展及色谱分离的影响色谱峰扩展及色谱分离的因素因素H=A+B/u+CuA=2dp液体流动

9、相的扩散系数很小液体流动相的扩散系数很小B0CuCAH流动相采用粘度小、低流速的匀的固定相：采用粒度小、填充均n 两者H-u曲线的形状相似 HPLC的板高极小值比GC的极小值小一个数量级，说明液相色谱的柱效高 HPLC的板高极小值对应流速比GC的流速小一个数量级2. 对速率方程的讨论 选用选用细颗粒细颗粒填料可获高柱效填料可获高柱效 流 动 相 流 速 低 ， 有 利 于 达 到 高 柱 效流 动 相 流 速 低 ， 有 利 于 达 到 高 柱 效1ml/min 选用选用黏度小的流动相黏度小的流动相有利于提高柱效有利于提高柱效 甲醇 温度的影响温度的影响室温250C左右 液膜厚度的影响液膜厚度

10、的影响第三节第三节 HPLCHPLC主要类型与分离原理主要类型与分离原理一、一、 液液-固吸附色谱固吸附色谱 固定相固定相：固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等，较常使固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是用的是510m的硅胶吸附剂；的硅胶吸附剂； 流动相流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。各种不同极性的一元或多元溶剂。 基本原理基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸。组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸。 应用：应用：对于对于异构体分离和族分离异构体分离和族分离是最有效的方法，是最有效的方法，如农药异构体分离，石油中烷、烯、芳烃的如农药异构体分离，石油中烷、烯、芳烃的分离。分离。 缺点是容

11、易产生不对称峰和拖尾现象。缺点是容易产生不对称峰和拖尾现象。p各组分的出峰顺序各组分的出峰顺序 极性极性较小较小组分，吸附力较弱，容易解吸，组分，吸附力较弱，容易解吸，先流出先流出。 极性极性较大较大组分滞留作用大，组分滞留作用大，后流出后流出。 二、二、 液液-液分配色谱液分配色谱 固定相与流动相均为液体（互不相溶）；固定相与流动相均为液体（互不相溶）； 基本原理基本原理：组分在固定相和流动相上的组分在固定相和流动相上的分配分配； 流动相流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，对于亲水性固定液，采用疏水性流动相， 即流动相的极性小于固定液的极性（即流动相的极性小于固定液的极性（正相正相