蛋白质纯化技术 - Lite

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1、蛋白质的分离纯化与鉴定蛋白质的分离纯化与鉴定Isolation, Purification and Identification of Protein分子生物学圣经分子生物学圣经分子克隆实验指南分子克隆实验指南为什么要纯化蛋白质？为什么要纯化蛋白质？理论意义：理论意义：深入研究某种蛋白质的功能深入研究某种蛋白质的功能以及作用机制，如信号通路中的蛋白以及作用机制，如信号通路中的蛋白质质应用价值应用价值-蛋白质工程蛋白质工程 医药、工业、科研医药、工业、科研 作为药物靶点作为药物靶点蛋白质是生命功能的执行者蛋白质是生命功能的执行者蛋白质工程中进行蛋白质纯化的必要性蛋白质工程中进行蛋白质纯化的必要性

2、 首先，需要单一的蛋白质作为实验材料，首先，需要单一的蛋白质作为实验材料，研究其结构与功能研究其结构与功能； 其次，其次，对蛋白质进行修饰改造对蛋白质进行修饰改造时需要单时需要单一的蛋白质作为原材料；一的蛋白质作为原材料； 最后，为了生产性能更优良的蛋白质，最后，为了生产性能更优良的蛋白质，需要对设计改造过的蛋白质进行大量纯需要对设计改造过的蛋白质进行大量纯化，从而化，从而开发出相关产品开发出相关产品。本章概要本章概要蛋白质纯化方法蛋白质纯化方法蛋白质纯化原则蛋白质纯化原则纯化步骤纯化步骤蛋白质的鉴定蛋白质的鉴定一、蛋白纯化方法一、蛋白纯化方法蛋白质纯化的根据：蛋白质纯化的根据： 不同的蛋白质

3、，理化性质不同。不同的蛋白质，理化性质不同。理化性质不同的原因：理化性质不同的原因： 氨基酸的数目和序列不同。氨基酸的数目和序列不同。1.与蛋白质分离纯化相关的理化特性与蛋白质分离纯化相关的理化特性分子大小分子大小分子形状分子形状带电特性带电特性溶解特性溶解特性与配体特异性结合不同与配体特异性结合不同吸附性质吸附性质变性和复性变性和复性1.1分子大小分子大小蛋白质分子大小主要取决于：蛋白质分子大小主要取决于： 蛋白质肽链的数目蛋白质肽链的数目 每条肽链的氨基酸残基数目。每条肽链的氨基酸残基数目。几百几百百万百万 Da常用方法常用方法 透析透析 超滤超滤 凝胶过滤凝胶过滤 离心离心 透析透析(d

4、ialysis)利用利用透析袋透析袋把大把大分子蛋白质与小分子蛋白质与小分子化合物分开分子化合物分开的方法。的方法。 超滤法超滤法 应用应用正压或离心力正压或离心力使蛋白质溶液透过使蛋白质溶液透过有一定截留分子量有一定截留分子量的超滤膜的超滤膜，达到浓，达到浓缩蛋白质溶液的目缩蛋白质溶液的目的。的。 超滤法超滤法 应用应用正压或离心力正压或离心力使蛋白质溶液透过使蛋白质溶液透过有一定截留分子量有一定截留分子量的超滤膜的超滤膜，达到浓，达到浓缩蛋白质溶液的目缩蛋白质溶液的目的。的。凝胶过滤凝胶过滤 是按照天然蛋白质是按照天然蛋白质相对分子相对分子质量大小质量大小进行分离的技术，又称进行分离的技术

5、，又称为为分子筛层析或排阻层析分子筛层析或排阻层析。 超速离心超速离心离心离心（centrifugation）：利用机械的快速：利用机械的快速旋转所产生的离心力，将不同密度的物旋转所产生的离心力，将不同密度的物质分离开来的方法。质分离开来的方法。 超速离心法超速离心法 (ultracentrifugation)：60万万 g ， 6万万8万万 r/min。可用来测定蛋白质分子。可用来测定蛋白质分子量。量。超速离心超速离心1.2分子形状分子形状形状形状 蛋白质在蛋白质在离心离心通过溶液时，或通过通过溶液时，或通过膜膜、凝凝胶过滤填料颗粒胶过滤填料颗粒或或电泳凝胶电泳凝胶中时，都会受中时，都会受到

6、分子形状的影响。到分子形状的影响。方法方法 梯度离心梯度离心 电泳电泳1.3电荷电荷原理原理蛋白质的净电荷与蛋白质蛋白质的净电荷与蛋白质等电点等电点pI以以及及环境环境pH值值有关（有关（pHpI，），）方法方法电泳电泳离子交换层析离子交换层析1.4溶解度溶解度原理原理 蛋白质分子表面蛋白质分子表面亲水性和疏水性带电基团亲水性和疏水性带电基团不同不同，因此在溶剂中的溶解度不同。，因此在溶剂中的溶解度不同。 通过通过改变改变pH、离子强度离子强度或或加入有机试剂加入有机试剂，促进蛋白质分子的凝聚进而形成沉淀。促进蛋白质分子的凝聚进而形成沉淀。方法：沉淀法方法：沉淀法 盐析法（盐析法（eg. 硫酸

7、铵）硫酸铵） 有机溶剂沉淀法（有机溶剂沉淀法（eg. 丙酮）丙酮） 等电点沉淀法等电点沉淀法 蛋白质在高浓度中性盐溶液中会沉淀析出，蛋白质在高浓度中性盐溶液中会沉淀析出，称为称为盐析。盐析。 盐析原理：盐析原理： 高浓度盐离子破坏蛋白质高浓度盐离子破坏蛋白质分子表面的水化分子表面的水化膜膜，影响蛋白质，影响蛋白质分子表面所带电荷分子表面所带电荷，从而，从而引起蛋白质沉淀，但通常不会引起蛋白质引起蛋白质沉淀，但通常不会引起蛋白质的变性。的变性。盐析法盐析法1.5配体特异性结合配体特异性结合 原理原理 生物大分子的某些特定结构区域能够生物大分子的某些特定结构区域能够特异性识特异性识别其他分子别其他

8、分子并并可逆结合可逆结合，生物分子间的这种结，生物分子间的这种结合能力称为合能力称为亲和力亲和力。 方法方法 将具有亲和力的两个分子中的一个固定在不溶将具有亲和力的两个分子中的一个固定在不溶性基质上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性基质上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性对另一个分子进行分离纯化。性对另一个分子进行分离纯化。 分类分类 免疫亲和层析免疫亲和层析 生物亲和层析生物亲和层析 金属螯合亲和层析金属螯合亲和层析1.6吸附性质吸附性质 原理原理 蛋白质可吸附在不同材料的表面，如金属、蛋白质可吸附在不同材料的表面，如金属、陶瓷、塑料等。陶瓷、塑料等。 方法方法 疏水层析疏水层析1.7变性和

9、复性变性和复性 原理原理 变性：变性：蛋白质在一定的理化条件下会失去原有蛋白质在一定的理化条件下会失去原有的空间结构、生物学功能及部分理化特性。的空间结构、生物学功能及部分理化特性。 复性：复性：当变性条件去除后恢复原有的空间结构当变性条件去除后恢复原有的空间结构及生物学功能。及生物学功能。 方法方法 如，利用尿素的变性和复性方法，从包涵体中如，利用尿素的变性和复性方法，从包涵体中纯化原核表达蛋白纯化原核表达蛋白2. 分离方法分离方法在实验操作上，分为：在实验操作上，分为：沉淀法沉淀法离心法离心法电泳法电泳法超滤法超滤法相分配法相分配法层析法层析法* *不可能有一套统一的方法适用于分离纯不可能

10、有一套统一的方法适用于分离纯化所有的蛋白质，化所有的蛋白质，* *但每一种蛋白质但每一种蛋白质可能可能都有一套适合的分都有一套适合的分离纯化程序，离纯化程序，* *而且所用的主要技术手段都基本相同。而且所用的主要技术手段都基本相同。Note二、蛋白质纯化的总原则和纯化步骤二、蛋白质纯化的总原则和纯化步骤总原则总原则以合理的效率、速度、收率和纯度，以合理的效率、速度、收率和纯度，将目标蛋白从细胞的全部其他成分，将目标蛋白从细胞的全部其他成分，特别是从杂蛋白中分离出来，特别是从杂蛋白中分离出来，同时仍保留其生物学活性和化学完整同时仍保留其生物学活性和化学完整性。性。二、蛋白质纯化的总原则和纯化步骤

11、二、蛋白质纯化的总原则和纯化步骤步骤步骤选择实验材料，实验材料预处理选择实验材料，实验材料预处理蛋白质的提取蛋白质的提取蛋白质的粗分级蛋白质的粗分级蛋白质的细分级蛋白质的细分级蛋白质的鉴定蛋白质的鉴定 蛋白质纯化的前期准备蛋白质纯化的前期准备 关于蛋白质我们已知什么？关于蛋白质我们已知什么？最好的来源？最好的来源？蛋白质纯度要求？活性要求？蛋白质纯度要求？活性要求？纯化蛋白的量？纯化蛋白的量？如何进行鉴定？如何进行鉴定？纯化时间长短？纯化时间长短？最终花费？最终花费？纯化方案？纯化方案？1、选择实验材料及预处理、选择实验材料及预处理选择实验材料选择实验材料 物种的选择物种的选择 组织的选择组织