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1、生物分离工程生物分离工程液相色谱液相色谱总体学习目的和要求总体学习目的和要求 了解色谱原理，掌握各种常用色了解色谱原理，掌握各种常用色谱方法的操作与应用谱方法的操作与应用 。 目录目录n色谱原理与分类色谱原理与分类n色色谱谱过程理论模型过程理论模型n分离度分离度n凝胶过滤凝胶过滤色色谱谱n离子交换离子交换色色谱谱n疏水性相互作用疏水性相互作用色色谱谱n流通流通色色谱谱色谱原理与分类色谱原理与分类学习要点学习要点n识记：识记：色色谱谱方法分类方法分类 n理解：理解：色色谱谱原理原理 色色谱谱原理与分类原理与分类定义（定义（chromatograph）n定义定义 p250p250 色色谱谱是根据混
2、合物中溶质在互不混溶的两相间分是根据混合物中溶质在互不混溶的两相间分配行为的差别而引起移动速度的不同而进行分离配行为的差别而引起移动速度的不同而进行分离的方法。的方法。色色谱谱原理与分类原理与分类原理（原理（2） 色色谱谱操作中互不混溶的操作中互不混溶的两相分别称为固定相和流两相分别称为固定相和流动相。固定相填充于柱内动相。固定相填充于柱内形成固定床，在柱的入口形成固定床，在柱的入口端加入料液后，连续输入端加入料液后，连续输入流动相，料液中溶质在流流动相，料液中溶质在流动相与固定相之间扩散传动相与固定相之间扩散传质，产生分配平衡质，产生分配平衡色色谱谱原理与分类原理与分类原理（原理（2） 在在
3、色色谱谱过程中，过程中，分配系数大的溶质在分配系数大的溶质在固定相上存在的概率固定相上存在的概率大，随流动相移动速大，随流动相移动速度小。由此，溶质之度小。由此，溶质之间由于移动速度的不间由于移动速度的不同而得到分离。同而得到分离。色色谱谱原理与分类原理与分类流动相分类流动相分类n气相气相色色谱谱n液相液相色色谱谱n超临界超临界色色谱谱（p290p290）色色谱谱原理与分类原理与分类固相分类固相分类n类型类型 分配分配色色谱谱（固定相为液相）（固定相为液相） 吸附吸附色色谱谱（固定相为固相）（固定相为固相）n形状形状 纸纸色色谱谱 薄层薄层色色谱谱 柱柱色色谱谱纸层析薄层层析色色谱谱原理与分类
4、原理与分类操作压力分类操作压力分类n低压液相低压液相色色谱谱（4.0 MPa）色色谱谱原理与分类原理与分类流动相流动方式分类流动相流动方式分类 p252n轴向流轴向流色色谱谱n径向流径向流色色谱谱色色谱谱原理与分类原理与分类分离操作方式分类分离操作方式分类 p252n洗脱洗脱色色谱谱n迎头迎头色色谱谱n顶替展开顶替展开（置换色谱（置换色谱 p298）色色谱谱原理与分类原理与分类机理分类机理分类n凝胶过滤凝胶过滤色色谱谱n离子交换离子交换色色谱谱n反相反相色色谱谱n疏水性相互作用疏水性相互作用色色谱谱n亲和亲和色色谱谱色谱过程理论模型色谱过程理论模型平衡模型平衡模型 p253n模型假设模型假设
5、整个层析柱中不存在传质阻力，分配平衡瞬整个层析柱中不存在传质阻力，分配平衡瞬间完成间完成 流动相的流动为平推流流动相的流动为平推流模型描述模型描述根据假设根据假设1 1：mscfc 根据假设根据假设2 2：01zcutctcmsm色色谱谱过程理论模型过程理论模型平衡模型平衡模型n溶质在溶质在色色谱谱柱中移动速度：柱中移动速度：n洗脱时间洗脱时间n洗脱体积洗脱体积mcHfudtdzv1mmRcHfcHfuLvLt11mRcHfVV01模型特点：模型特点：平衡模型形式简单，但信息量少，可用于解释一些基本色谱现象色色谱谱过程理论模型过程理论模型平衡模型解释某些色谱现象平衡模型解释某些色谱现象 p25
6、4n拖尾现象拖尾现象优惠吸附中：优惠吸附中：mcmfcv洗脱时间短n吐舌现象吐舌现象非优惠吸附中：非优惠吸附中：mcmfcv洗脱时间短色谱过程理论模型色谱过程理论模型理论板模型理论板模型 p255n模型假设模型假设 溶质的分配平衡不能瞬间完成，需要一定的柱高溶质的分配平衡不能瞬间完成，需要一定的柱高n模型示意模型示意色色谱谱过程理论模型过程理论模型理论板模型的特性值理论板模型的特性值 p257n平均洗脱时间平均洗脱时间n散度散度n底线处切线峰宽底线处切线峰宽n高度处峰宽高度处峰宽n理论板理论板mHtRR12212254. 516WWNRRR354. 221WNmHW144NmH22221色色谱
7、谱过程理论模型过程理论模型理论板模型特点理论板模型特点n仅用一个仅用一个理论板数理论板数或或HETP描述层析柱描述层析柱分离性能，使用方便；分离性能，使用方便；n适用于适用于低低料液浓度的料液浓度的色色谱谱过程过程n无法确定影响分离性能的因素无法确定影响分离性能的因素 色色谱谱过程理论模型过程理论模型轴向扩散模型及等板高度轴向扩散模型及等板高度 p259n轴向扩散模型方程形式轴向扩散模型方程形式n等板高度等板高度tcHzcuzcDtcsmmzm22 222121302mHmHDuduDLHETPepz色色谱谱过程理论模型过程理论模型Van Deemter方程方程轴向扩散系数Dz轴向分子扩散轴向
8、分子扩散流速的不均匀现象流速的不均匀现象与u无关与udp成正比通用方程：通用方程：CuBuAHETPAeddy diffusion涡流扩散 Blongitudinal diffusion纵向扩散 Cmass transfer resistance界面传质阻力 分离度分离度学习要点学习要点n识记：识记：分离度的概念分离度的概念 n理解：理解：如何分离度判断两个相邻洗脱峰如何分离度判断两个相邻洗脱峰的分离程度的分离程度 分离度分离度定义及表述定义及表述 p260n定义定义 分离度又称分辨率，是表达两种洗脱曲线相分离度又称分辨率，是表达两种洗脱曲线相邻的溶质相互分离的程度邻的溶质相互分离的程度 n分
9、离度的表达分离度的表达nGaussGauss洗脱曲线的分离度洗脱曲线的分离度21122WWRRRS12211242 2SmmNRm Fm F分离度的其它表征方法分离度的其它表征方法容量因子和选择性容量因子和选择性n容量因子容量因子 容量因子是固定相与流动相间溶质分配量之比，用容量因子是固定相与流动相间溶质分配量之比，用kk表示表示n选择性选择性 选择性为洗脱峰相邻的两种溶质的容量因子之比选择性为洗脱峰相邻的两种溶质的容量因子之比22114121kkNRS121224 1SkkRNk凝胶过滤凝胶过滤色色谱谱学习要点学习要点n理解：理解：凝胶过滤的原理和操作，凝胶过凝胶过滤的原理和操作，凝胶过滤介
10、质的要求和影响分离特性的因素滤介质的要求和影响分离特性的因素 n应用：应用：掌握凝胶掌握凝胶色色谱谱的应用及特点的应用及特点 凝胶过滤凝胶过滤色色谱谱定义定义 凝胶过滤凝胶过滤色色谱谱利用凝胶粒子为固定利用凝胶粒子为固定相，是根据料液中溶质相对分子量的差相，是根据料液中溶质相对分子量的差别进行分离的液相别进行分离的液相色色谱谱法法 凝胶过滤凝胶过滤色色谱谱原理原理n在在GFC柱中，分子量大的溶质柱中，分子量大的溶质不能进入凝胶介质，而沿介质不能进入凝胶介质，而沿介质空隙流过空隙流过n分子量很小的溶质能够进入所分子量很小的溶质能够进入所有的细孔中，其洗脱体积接近有的细孔中，其洗脱体积接近柱体积柱
11、体积n分子两介于两者之间的溶质能分子两介于两者之间的溶质能够进入部分细孔中够进入部分细孔中凝胶过滤凝胶过滤色色谱谱原理原理(2)凝胶过滤凝胶过滤色色谱谱分配系数分配系数n凝胶过滤凝胶过滤色色谱谱的分配系数的分配系数可用下式表示可用下式表示nGFC的分配系数在的分配系数在01之间，分离精度有限。之间，分离精度有限。00tVmVVV Smallest solute: (acetone) Full access to the pores, Vt;Largest solute: (Blue Dx 2000) Excluded from the pores, V0凝胶过滤色谱凝胶过滤色谱影响分配系数因素
12、影响分配系数因素n相对分子量相对分子量 相对分子量一定的溶质的相对分子量一定的溶质的m值为常数，为凝胶介质对该值为常数，为凝胶介质对该溶质的有效孔隙率溶质的有效孔隙率p； 分配系数随相对分子量的分配系数随相对分子量的 增加而降低；增加而降低；n分子形状分子形状n凝胶结构凝胶结构凝胶过滤凝胶过滤色色谱谱介质应满足条件介质应满足条件p263n亲水性高，表面惰性亲水性高，表面惰性n稳定性好，在较宽的稳定性好，在较宽的pH和离子强度范围及化和离子强度范围及化学试剂中保持稳定，使用寿命长；学试剂中保持稳定，使用寿命长；n具有一定的孔径分布范围；具有一定的孔径分布范围；n机械强度高，允许较高的操作压力；机
13、械强度高，允许较高的操作压力；凝胶过滤凝胶过滤色色谱谱常用的常用的GFC介质介质n葡聚糖凝胶介质葡聚糖凝胶介质 葡聚糖（右旋糖酐）与环氧氯丙烷合成葡聚糖（右旋糖酐）与环氧氯丙烷合成n琼脂糖凝胶介质琼脂糖凝胶介质 琼脂糖与环氧氯丙烷合成琼脂糖与环氧氯丙烷合成n其他亲水性高分子合成的凝胶介质其他亲水性高分子合成的凝胶介质n多种多糖制备的凝胶介质多种多糖制备的凝胶介质Sephadex GSepharose CL/FFTSKSuperose凝胶过滤凝胶过滤色色谱谱凝胶特性参数凝胶特性参数p265n排阻极限排阻极限 不能扩散到凝胶网络内部的最小分子的相对分子质量不能扩散到凝胶网络内部的最小分子的相对分子
14、质量n分级范围分级范围 能为凝胶阻滞并且相互之间可以得到分离的溶质的相对分子能为凝胶阻滞并且相互之间可以得到分离的溶质的相对分子量范围量范围n溶胀率溶胀率 介质溶胀后每千克干凝胶所吸收的水分的百分数介质溶胀后每千克干凝胶所吸收的水分的百分数其他参数其他参数 凝胶粒径、床体积、空隙体积凝胶粒径、床体积、空隙体积凝胶过滤凝胶过滤色色谱谱影响操作的因素影响操作的因素p266n线速度线速度n料液体积料液体积n料液浓度料液浓度n分子量与分配系数关系分子量与分配系数关系n凝胶粒径凝胶粒径凝胶过滤凝胶过滤色色谱谱应用应用n分离纯化分离纯化n脱盐脱盐n相对分子量测定相对分子量测定凝胶过滤凝胶过滤色色谱谱特点特
15、点p270n溶质与介质溶质与介质不发生任何形式的相互作用不发生任何形式的相互作用，因此可采，因此可采用恒定洗脱法洗脱展开，操作条件温和，产品收率用恒定洗脱法洗脱展开，操作条件温和，产品收率接近接近100%；n分离结束后分离结束后无需苛刻的介质清洗或再生无需苛刻的介质清洗或再生，循环操作，循环操作易实现，提高了产品纯度；易实现，提高了产品纯度；n作为脱盐手段，作为脱盐手段，GFC比透析法速度快、精度高；比透析法速度快、精度高；与超滤法相比，剪切应力小，蛋白活性收率高；与超滤法相比，剪切应力小，蛋白活性收率高；n分离机理简单，操作参数小，规模放大容易；分离机理简单，操作参数小，规模放大容易；凝胶过
16、滤凝胶过滤色色谱谱不足不足n仅根据溶质间相对分子质量的差异进行分离，仅根据溶质间相对分子质量的差异进行分离，选择性低，料液处理量小选择性低，料液处理量小，一般为柱体积的，一般为柱体积的5%；n经经GFC洗脱展开后产品洗脱展开后产品被稀释被稀释，因此需要在，因此需要在其它浓缩作用的单元操作后使用；其它浓缩作用的单元操作后使用；凝胶层析的应用范围：凝胶层析的应用范围： 凝胶层析法适用于分离和提纯蛋白质、酶、多肽、激素、多糖、核酸类等物质。分子大小彼此相差25%的样品，只要通过单一凝胶床就可以完全将它们分开。利用凝胶的分子筛特性，可对这些物质的溶液进行脱盐、浓缩、去热源和脱色。凝胶层析的优点凝胶层析
17、的优点 凝胶层析具有设备简单、操作方便、分离迅速及不影响分子生物学活性等优点。目前已被广泛应用于各种生化产品的分离和纯化。例：凝胶柱层析分析蛋白例：凝胶柱层析分析蛋白质分子量大小质分子量大小 实验原理实验原理 凝胶层析凝胶层析n 当某组分的Ka=0时(即Ve=Vo)，说明该组分完全不进入凝胶颗粒微孔，洗脱时最先流出n 若某组分的Ka=1(即Ve=Vo+Vi)时，说明该组分可自由地扩散进入凝胶颗粒内部的微孔中，洗脱时，最后流出n Ka在0-1之间的组分，洗脱时Ka值小的先流出 ，Ka值大的后流出。在限定的条件下，Vi和Vo都是恒定值n 在一般情况下，凝胶对组分没有吸附作用。当洗脱液的体积等于Vo
18、+Vi时，所有组分都应该被洗脱出来，即Ka的最大值为1。然而在某种情况下Ka值会大于1。这种反常现象说 明这一层析过程不是单纯的凝胶层析，其中可能还夹杂有吸附或离子交换等过程 洗脱体积与相对分子质量的关系 1.大豆蛋白酶抑制剂；2.细丙二聚体；胰蛋白酶原；4.卵清蛋白；5.血清蛋白；6.血清蛋白二聚体；7.IgG；8.甲状腺球蛋白；9。蔗糖；10.糖原；11.细丙551；12.细丙；13.Rnase;14. -乳清蛋白；15.肌红蛋白 上方曲线为G-75；下方曲线为G-100 蛋白质通过凝胶柱的速度即洗脱体积与其分蛋白质通过凝胶柱的速度即洗脱体积与其分子量有关子量有关（VeVe为洗脱体积）为洗
19、脱体积）LogMLogM=k=k1 1-k-k2 2VeVe先测得几种标准蛋白质的先测得几种标准蛋白质的VeVe，并以其分子量对数对并以其分子量对数对VeVe作图得一直线，再测出作图得一直线，再测出待测样品的待测样品的VeVe，查标准曲查标准曲线即可确定分子量。线即可确定分子量。LogMLogMA AB BC CLogMLogM测测V V测测柱层析装置柱层析装置( (恒流泵 层析柱 收集器 主机 记录仪等5件套) ) 三三. 仪器和试剂仪器和试剂 层析柱层析柱（a）自制简易层祈柱（1玻璃管；2.橡皮塞；3尼龙网）；（b）普通商品柱；（c）双底板层析柱（1.洗脱液进出口；2.多孔底板；3柱床；4
20、恒温水进口；5恒温水出口；6可调节的塞子） 层析系统连接示意图 1密封橡皮塞；2恒压管，3，恒压瓶；4，层析流出液，5可调蜾旋夹；6.自动收集器； 7.核酸一蛋白质检测仪 BSBS100100自动部分收集器安装圈自动部分收集器安装圈1反全阀；2换管臂；3滴管；4，5换管臂固定螺丝；6.竖杆；7.竖杆囤定螓丝；8报警板；9.试管；10收集盘；11.时间选挥旋钮；12.时间选择固定螺钉；13自动开关；14、指示灯；15.电源开关；16换向开关（逆、顺）；17手动开关操作步骤操作步骤 1.装柱：凝胶溶胀后，湿法装柱，以柱床均匀、无气泡表面平整为佳 一般选用细长的拄作凝胶过滤。进行脱盐时，柱高50cm
21、比较合适；分级分离时，100cm就足够了。 一般是在柱内先装入约1/3高度的水或缓冲液，然后将溶胀好的凝胶在搅拌成稀浆的情况下慢慢倒入柱内，使其自然沉降。如此连续操作，可以得到一个均匀的柱床。柱装得不好往往造成洗脱区带加宽，甚至使一些本来可以分开的区带重叠。如装柱时的操作压力太大，会使凝胶床压得太实，从而降低流速。2. 系统平衡：连接各装置，用缓冲液洗涤柱子，并打开检测器，使检测器稳定 新柱装好后，要用洗脱缓冲液平衡，一般用3-5倍体积的缓冲液在恒压下流过柱床。 新装好的柱要检验其均匀性可用带色的高分子物质如蓝色葡聚糖-2000配成2mg/mL的溶液过柱，观察色带是否均匀下降。也可以对光检查，
22、看其是否均匀或有无气泡存在。3. 上样：分别加标准分子量蛋白质和样品。 由于凝胶层析的稀释作用，似乎样品浓度应尽可能大才好，但样品浓度过大往往导致粘度增大，而使层析分辨率下降（下图）。一般要求样品粘度小于0.01Pas（帕斯卡秒），这样才不致于对分离造成明显影响。对蛋白质类样品浓度以不大于4为宜。如果样品浑浊，应先过滤或离心除去颗粒后上柱。分析用量一般为每100mL床体积加样品1-2mL，制备用量一般为每100 mL床体积加样品20-30 mL，这样可使样品的洗脱体积小于样品各组分之间的分离体积，获得较满意的分离效果。 加样时应尽量减少样品的稀释，及凝胶床面的搅动。这一点在分级分离时尤为重要。
23、 样品黏度对洗脱曲线的影响（1）加葡萄糖2 000，使终浓度为5%，相对粘度11.8;（2）加葡萄糖2 000，使终浓度为2.5%，相对粘度4.2; （3）加葡萄糖2 000，使终浓度为1%. u 注意事项 要通过实验合理调整流速、检测器和记录仪的灵敏度，和记录仪的走纸速度，才能获得良好的洗脱曲线 若峰有重叠，宜加长柱子，降低流速 若峰间距离过大，峰过宽，宜缩短柱子，加快流速，降低走纸速度 峰过高，可减少加样量，或降低检测器和记录仪的灵敏度 峰过低则需加大灵敏度，或加大加样量。 4. 洗脱、记录 为了防止柱床体积的变化，造成流速降低及重复性下降。整个洗脱过程中始终保持一定的操作压，并不超限是很
24、必要的。流速不宜过快且要稳定。冼脱液的成分也不应改变，以防凝胶颗粒的涨缩引起柱床体积变化或流速改变。在许多情况下可以用水作洗脱剂，但为了防止非特异吸附，避免一些蛋白质在纯水中难以溶解（析出沉淀），以及蛋白质稳定性等问题的发生，常采用缓冲盐溶液进行洗脱。离子浓度至少0.02mol/L方可获得较好的结果，因为凝胶含有少量羧基，会吸附少量阳离子而排斥少量阴离子。洗脱用盐等介质应比较容易除去才好，通常，氨水、醋酸、甲酸铵等易发挥的物质用得较多。对一些吸附较强的物质也可采用水和有机溶剂（如水-甲醇，水-丙酮等）的混合物进行洗脱。 洗脱剂的流速对分离效果也有很大影响，下图显示了同一凝胶柱在不同流速下的洗脱
25、曲线。可见较快的流速下得到的冼脱峰也宽。流速低洗脱峰窄而高。也就是说，流速较低，分辨率较高，样品稀释较轻。 流速对洗脱曲线的影响流速对洗脱曲线的影响 凝胶层析拄洗脱的三部分示意图 各种层析柱装置的操作压（或静水压）各种层析柱装置的操作压（或静水压）（a），（b）操作压等于柱或贮液器内液面和出水接管末端的高度差；（c），（d）压力的大小是由恒压瓶内空气入口管的底部至出口接管末端的高度计算。向下（c）或向上（d）移动出水管无关紧要 欲达到流速恒定的目的，可自制恒压加液装置（下图），更可靠的是使用微量恒流泵。 凝胶层析恒压加液装置凝胶层析恒压加液装置 5. 结果计算及分析凝胶的再生和保养凝胶的再生和
26、保养 在洗脱过程中，所有组分一般都可被洗脱下来，所以装好柱后，可反复使用，无需特殊的再生处理。但多次使用后，凝胶颗粒可能逐渐沉积压紧，流速变慢。这时只需将凝胶自柱内倒出，重新填装。或使用反冲法，使凝胶松散冲起，然后自然沉降，形成新的柱床，这样流速会有所改善。 葡萄糖凝胶和琼脂糖凝胶都是碳水化合物，能被微生物（如细菌和霉菌）分解。聚丙烯酰胺凝胶本身不被微生物作用，但微生物还是能在此凝胶液中和凝胶床上生长，这样会破坏凝胶的特性，影响分离效果。为防止细菌生长和发酵，可用0.020.02叠氮化钠、叠氮化钠、0.05%0.05%三氯叔丁三氯叔丁醇（仅在弱酸有效，也适用于其他离子交换剂）醇（仅在弱酸有效，
27、也适用于其他离子交换剂）或或0.0020.002洗必泰、洗必泰、0.010.01醋酸苯汞（在弱碱醋酸苯汞（在弱碱中有效，也适用于其他阴离子交换剂）以及中有效，也适用于其他阴离子交换剂）以及0.1mol0.1molL L氢氧化钠溶液等作防腐剂氢氧化钠溶液等作防腐剂。层析前再用水或平衡液将防腐剂洗去。 凝胶用过后，有几种保存方法：凝胶用过后，有几种保存方法：湿态保存：在水相中加防腐剂，或水洗到中性，高压灭菌封存（或低温存放）；半收缩保存：水洗后滤干，加70乙醇使胶收缩，再浸泡于70乙醇中保存；干燥保存：水洗后滤干，依次用50、70、90、95乙醇脱水，再用乙醚洗去乙醇，干燥(或6080烘干）后保存
28、。加乙醇时，切忌一上来就用浓乙醇处理，以防结块。凝胶过滤层析经常遇见的问题凝胶过滤层析经常遇见的问题 1 1流速慢流速慢 （1）有气泡、出水管阻塞 （2）没打开夹子（3）柱压太紧（操作压过大、长期使用、接头漏气） 2 2拄内产生气泡拄内产生气泡 （1）上水口不流或皮管破裂，洗脱液外流 （2）接口漏气，如上水口螺丝拧的不紧 3 3条带扭曲条带扭曲 （1）胶面不平 （2）样品或洗脱液中有颗粒 （3）装拄不均匀 4 4分辩率不高分辩率不高 （1）装拄不均匀 （2）样品量过大 （3）流速太快 （4）拄不垂直或拄不合适 （7）胶不适当（5）长菌 （6）拄下口软管太长离子交换离子交换色色谱谱学习要点学习要
29、点n理解：理解：离子交换离子交换色色谱谱的原理和操作，线的原理和操作，线性剃度洗脱过程和逐次洗脱过程性剃度洗脱过程和逐次洗脱过程 n应用：应用：掌握离子交换掌握离子交换色色谱谱的应用特点的应用特点 离子交换离子交换色色谱谱概念概念 离子交换离子交换色色谱谱利用利用离子交换剂为固定离子交换剂为固定相，是根据相，是根据荷电溶荷电溶质与离子交换剂之质与离子交换剂之间的静电相互作用间的静电相互作用力力的差别进行溶质的差别进行溶质分离的洗脱分离的洗脱色色谱谱法法阳阳离离子子交交换换层层析析过过程程离子交离子交换树脂换树脂蛋白质蛋白质高离子高离子强度洗强度洗脱液洗脱液洗高离子高离子强度洗强度洗脱液洗脱液洗
30、加加样样平平衡衡液液洗洗收集收集离子交换离子交换色色谱谱分配系数分配系数n溶质在离子交换剂上的分配系数可表示为溶质在离子交换剂上的分配系数可表示为其中其中m为离子强度无限大时溶质的分配系数为离子强度无限大时溶质的分配系数n分配系数对分配系数对I 很敏感，很敏感，I 微小的变化都会引起微小的变化都会引起分配系数的改变；分配系数的改变；n不同蛋白质不同蛋白质B值相差很大值相差很大 mIAImB离子交换离子交换色色谱谱主要阴离子交换配基主要阴离子交换配基二乙胺乙基，二乙胺乙基，Diethylaminoethyl (DEAE) Quaternary aminoethyl (QAE)季胺乙基，季胺乙基，
31、Quaternary ammonium (Q)离子交换离子交换色色谱谱主要阳离子交换配基主要阳离子交换配基羧甲基，羧甲基，Carboxymethyl (CM)磺丙基，磺丙基，Sulphopropyl (SP)Methyl sulphonate (S)离子交换离子交换色色谱谱线性洗脱法线性洗脱法n线形洗脱法（线形洗脱法（linear gradient elution) 流动相的离子强度流动相的离子强度线性线性增大，因此溶质的分配系数连续降低，增大，因此溶质的分配系数连续降低，移动速度逐渐增大移动速度逐渐增大n特点特点 难于洗脱的溶质在较小流动相体积下洗脱；难于洗脱的溶质在较小流动相体积下洗脱；
32、改变流动相离子强度增大速度可调节溶质的洗脱体积；改变流动相离子强度增大速度可调节溶质的洗脱体积； 流动相离子强度（盐浓度）连续增大，不出现干扰峰，操作流动相离子强度（盐浓度）连续增大，不出现干扰峰，操作范围广；范围广； 需要特殊调配浓度梯度的设备需要特殊调配浓度梯度的设备离子交换离子交换色色谱谱阶跃梯度洗脱法阶跃梯度洗脱法n阶跃梯度洗脱法（阶跃梯度洗脱法（Stepwise elution） 流动相的离子强度流动相的离子强度阶跃增大阶跃增大，溶质的分配系数的降低和移动，溶质的分配系数的降低和移动速度的增大也是速度的增大也是阶段式阶段式的。的。n特点特点 当阶跃速度很快，则其接近线性梯度洗脱；反之
33、，则接近恒当阶跃速度很快，则其接近线性梯度洗脱；反之，则接近恒定洗脱；定洗脱； 利用切换不同盐浓度的流动相进行洗脱，不需要特殊梯度设利用切换不同盐浓度的流动相进行洗脱，不需要特殊梯度设备，操作简便；备，操作简便； 流动相浓度不连续变化，易出干扰峰；流动相浓度不连续变化，易出干扰峰； 易出现多组分洗脱峰重叠现象；易出现多组分洗脱峰重叠现象；离子交换离子交换色色谱谱洗脱时间洗脱时间线性梯度洗脱过程中溶质的迁移速度线性梯度洗脱过程中溶质的迁移速度vp为为 1ppdzuvdtmHIm(I)不再为常数，不再为常数，而是而是I的函数的函数 由于与生物大分子相比，由于与生物大分子相比，IEC柱内盐离子在固定
34、相粒子内柱内盐离子在固定相粒子内传质非常快，盐离子在两相间的平衡瞬间完成，则传质非常快，盐离子在两相间的平衡瞬间完成，则mcHfudtdzv1sIIm I对盐离子而言，可有如下的方程：对盐离子而言，可有如下的方程：22SzIIIIIDuFtzzt对线性梯度而言对线性梯度而言Iz常数220Iz离子交换离子交换色色谱谱洗脱时间洗脱时间(2) p276 通过测定不同流动相离子强度梯度下溶质洗脱位置通过测定不同流动相离子强度梯度下溶质洗脱位置离子强度离子强度Ip值，可获得值，可获得Ip与与GH之间的关系曲线之间的关系曲线 0GHpIIIpfdIm ImI0GHtIVVV其中其中01pIRIILFmtI
35、V Fu洗脱时间为：洗脱时间为：（P275 图图7-21）离子交换离子交换色色谱谱 IEC柱内溶质迁移柱内溶质迁移n在线性梯度洗脱条件下，在线性梯度洗脱条件下，IEC柱内溶质区带的后部柱内溶质区带的后部移动速度高于前部，即线性梯度洗脱具有移动速度高于前部，即线性梯度洗脱具有区带浓缩区带浓缩作用；作用；n由于轴向返混和传质阻力的影响，溶质区带在洗脱由于轴向返混和传质阻力的影响，溶质区带在洗脱过程中过程中不断分散不断分散；n洗脱操作前期，返混等占主导地位，区带宽度不断洗脱操作前期，返混等占主导地位，区带宽度不断增加；增加；n随着区带宽度的增加，区带前后溶质运动速度差增随着区带宽度的增加，区带前后溶
36、质运动速度差增大，即浓缩作用增大大，即浓缩作用增大n当区带宽度增至一定值后，浓缩与分散作用达到平当区带宽度增至一定值后，浓缩与分散作用达到平衡，区带将以一定的宽度向下移动衡，区带将以一定的宽度向下移动离子交换离子交换色色谱谱 分离度分离度n当离子强度梯度一定时，分离度与柱高无关当离子强度梯度一定时，分离度与柱高无关n当柱高一定时，分离度随离子强度梯度的降低而增大当柱高一定时，分离度随离子强度梯度的降低而增大n分离度与分离度与 成反比成反比 12213122101118HETPppISIILFFmJRFmIVIV11221011HETPHETPCSRIVIVLVA12pd u离子交换离子交换色色
37、谱谱特点特点n料液处理量大，具有浓缩作用；料液处理量大，具有浓缩作用；n应用范围广泛，通过优化条件可大幅度提高分离的应用范围广泛，通过优化条件可大幅度提高分离的选择性，所需柱长短；选择性，所需柱长短；n吸附作用机理明确，非特异性吸附小，产品回收率吸附作用机理明确，非特异性吸附小，产品回收率高；高；n离子交换剂种类多，选择余地大，价格远低于亲和离子交换剂种类多，选择余地大，价格远低于亲和吸附剂；吸附剂；n影响分离特性因素复杂；影响分离特性因素复杂；疏水性相互作用疏水性相互作用色色谱谱学习要点学习要点n理解：原理，影响疏水性吸附的因素理解：原理，影响疏水性吸附的因素 n应用：掌握疏水性相互作用应用
38、：掌握疏水性相互作用色色谱谱方法对方法对蛋白质分离蛋白质分离 疏水性相互作用疏水性相互作用色色谱谱定义定义 疏水性相互作用疏水性相互作用色色谱谱利用表面偶联弱疏水性利用表面偶联弱疏水性基团（疏水性配基）的疏水性吸附剂为固定基团（疏水性配基）的疏水性吸附剂为固定相，根据蛋白质与疏水性吸附剂之间的相，根据蛋白质与疏水性吸附剂之间的弱疏弱疏水性相互作用水性相互作用的差别进行蛋白质类生物大分的差别进行蛋白质类生物大分子分离纯化的洗脱子分离纯化的洗脱色色谱谱法。法。疏水性相互作用疏水性相互作用色色谱谱原理原理n组成蛋白质的氨基酸中包括一些组成蛋白质的氨基酸中包括一些疏水性氨基酸疏水性氨基酸基团，如苯丙基
39、团，如苯丙氨酸，酪氨酸；氨酸，酪氨酸；n这些基团大部分处于蛋白质内部，但有这些基团大部分处于蛋白质内部，但有部分疏水基团暴露于部分疏水基团暴露于蛋白质表面蛋白质表面；n在在高离子强度高离子强度盐溶液中，蛋白质表面的盐溶液中，蛋白质表面的水化层被破坏水化层被破坏，更多更多的疏水部分暴露在外的疏水部分暴露在外n这些暴露在外的这些暴露在外的疏水基团疏水基团与介质上的与介质上的弱疏水性配基弱疏水性配基发生疏水发生疏水性作用，被固定相吸附性作用，被固定相吸附n蛋白质在疏水性吸附剂上的蛋白质在疏水性吸附剂上的分配系数分配系数随流动相盐析随流动相盐析盐浓度盐浓度的的提高而增大提高而增大nHIC采用采用高盐下
40、吸附高盐下吸附，低盐下洗脱低盐下洗脱疏水性相互作用疏水性相互作用色色谱谱原理图示原理图示疏水性相互作用疏水性相互作用色色谱谱疏水性吸附剂疏水性吸附剂n常用配基常用配基 苯基、短链烷基、苯基、短链烷基、 烷氨基、聚乙二醇聚醚烷氨基、聚乙二醇聚醚n修饰密度修饰密度 疏水配基修饰密度一般在疏水配基修饰密度一般在1040 umol/ml 疏水性吸附作用与配基的疏水性和配基目的疏水性吸附作用与配基的疏水性和配基目的成正比，故配基的修饰密度应根据配基的疏水成正比，故配基的修饰密度应根据配基的疏水性而异性而异。影响疏水性吸附的因素影响疏水性吸附的因素 p282离子强度、种类和破坏水化作用的物质离子强度、种类
41、和破坏水化作用的物质n离子强度及种类离子强度及种类 蛋白质的疏水性吸附作用随离子强度提高而增大；蛋白质的疏水性吸附作用随离子强度提高而增大； 离子的种类也对蛋白质疏水性吸附有着重要影响离子的种类也对蛋白质疏水性吸附有着重要影响n破坏水化作用的物质破坏水化作用的物质 离子半径大、电荷密度低的阴离子可减弱水分子间相互作用，离子半径大、电荷密度低的阴离子可减弱水分子间相互作用，具有破坏水化作用的性质（离液离子）具有破坏水化作用的性质（离液离子） 离液离子存在下疏水性作用减弱；离液离子存在下疏水性作用减弱； 乙二醇和丙三醇等含羟基的物质也具有影响水化的作用，降乙二醇和丙三醇等含羟基的物质也具有影响水化
42、的作用，降低蛋白疏水性吸附作用，作为洗脱促进剂；低蛋白疏水性吸附作用，作为洗脱促进剂；影响疏水性吸附的因素影响疏水性吸附的因素离液离子及顺序离液离子及顺序影响疏水性吸附的因素影响疏水性吸附的因素表面活性剂及温度表面活性剂及温度n表面活性剂表面活性剂 表面活性剂可与吸附剂及蛋白质的疏水部位结合，表面活性剂可与吸附剂及蛋白质的疏水部位结合，从而减弱蛋白质的疏水性吸附从而减弱蛋白质的疏水性吸附。n温度温度 一般吸附为放热过程，而一般吸附为放热过程，而疏水性吸附的结合作用随疏水性吸附的结合作用随温度升高而增大温度升高而增大2ln0dKHdTRT疏水性相互作用疏水性相互作用色色谱谱特点特点 p284n在
43、高盐浓度下疏水作用较大，在高盐浓度下疏水作用较大，HIC可直接分可直接分离盐析后蛋白质溶液离盐析后蛋白质溶液n可通过调节疏水性配基链长和密度调节可通过调节疏水性配基链长和密度调节HIC的吸附力的吸附力n吸附剂种类多，选择余地大吸附剂种类多，选择余地大反相反相色色谱谱学习要点学习要点 p287p287n理解理解：反相色谱技术的原理及操作，：反相色谱技术的原理及操作，n应用应用：了解反相色谱技术的应用范围及：了解反相色谱技术的应用范围及优缺点优缺点 反相反相色色谱谱定义定义n定义定义 利用表面利用表面非极性非极性的反相介质为固定相，极性有机溶剂的的反相介质为固定相，极性有机溶剂的水溶液为流动相，是
44、根据溶质极性（疏水性）的差别进水溶液为流动相，是根据溶质极性（疏水性）的差别进行分离纯化的洗脱层析法行分离纯化的洗脱层析法n与与HIC的异同的异同 反相层析中溶质亦通过疏水性作用分配于固定相表面；反相层析中溶质亦通过疏水性作用分配于固定相表面； 反相层析固定相表面完全被非极性基团所覆盖，表现强反相层析固定相表面完全被非极性基团所覆盖，表现强烈的疏水性；烈的疏水性； 必须采用极性有机溶剂或其水溶液进行洗脱必须采用极性有机溶剂或其水溶液进行洗脱反相反相色色谱谱分配系数分配系数n溶质在反相溶质在反相色色谱谱中分配系数取决于溶质的疏中分配系数取决于溶质的疏水性，疏水性越大，分配系数越大；水性，疏水性越
45、大，分配系数越大；n当固定相一定时，可通过调节流动相的组成当固定相一定时，可通过调节流动相的组成调整溶质的分配系数；调整溶质的分配系数；n流动相的极性越大，溶质的分配系数越大，流动相的极性越大，溶质的分配系数越大，因此反相层析多采用降低流动相极性的线性因此反相层析多采用降低流动相极性的线性梯度洗脱法梯度洗脱法反相反相色色谱谱常用介质常用介质n载体载体 硅胶、高分子聚合物微球硅胶、高分子聚合物微球n配基配基 丁烷基丁烷基(C4)、辛烷基、辛烷基(C8)、十八烷基、十八烷基(C18)或苯基或苯基n修饰方法修饰方法反相反相色色谱谱特点特点 p289p289n反相介质性能稳定，分离效率高；反相介质性能
46、稳定，分离效率高；n应用广泛，可用于分离蛋白质、肽、氨基酸、应用广泛，可用于分离蛋白质、肽、氨基酸、多糖、植物碱等，应用于科学研究、临床诊多糖、植物碱等，应用于科学研究、临床诊断、工业检测和环境保护等各个行业；断、工业检测和环境保护等各个行业；n作为产品纯化制备手段，多限于实验室规模作为产品纯化制备手段，多限于实验室规模的应用。的应用。流通流通色色谱谱学习要点学习要点n理解：理解：流通流通色色谱谱技术的原理及操作技术的原理及操作 n应用：应用：了解了解流流通通色色谱谱技术的应用范围及技术的应用范围及优缺点优缺点 流通流通色色谱谱定义定义p291n定义定义 流通流通色色谱谱指利用含有对流孔的介质
47、为固定相指利用含有对流孔的介质为固定相的液相的液相色色谱谱法法流通色谱作为一种分离模式，可包括各种吸附色谱，如IEC(ion exchange chromatography)、HIC(Hydrophbic Interaction Chromatography )、AC(adsorption chromatography)和RPC(Reversed Phase Chromatography )流通流通色色谱谱传统传统色色谱谱的缺陷的缺陷n传统的吸附传统的吸附色色谱谱介质孔径较小，一般在介质孔径较小，一般在100nm以下，流体阻力大；以下，流体阻力大；n通常的通常的色色谱谱操作压力下流体无法进入固
48、定相操作压力下流体无法进入固定相介质的孔内，孔内传质为扩散传质；介质的孔内，孔内传质为扩散传质；n柱效随流速增大而迅速下降，动态吸附容量柱效随流速增大而迅速下降，动态吸附容量亦如此；亦如此；流流通通色色谱谱介质结构介质结构 p292n穿透孔穿透孔 孔径在孔径在0.60.8 um, 孔内孔内流动为流动为对流对流形式；形式；n扩散孔扩散孔 孔径在孔径在50100 nm, 孔内孔内传质为传质为扩散传质扩散传质；流流通通色色谱谱介质结构的特点介质结构的特点 p293n流流通通色色谱谱介质穿透孔之间以扩散孔相连，保介质穿透孔之间以扩散孔相连，保证了介质大的比表面积和溶质吸附量证了介质大的比表面积和溶质吸
49、附量n扩散孔长度大大缩短，降低了扩散传质阻力；扩散孔长度大大缩短，降低了扩散传质阻力；n色色谱谱操作线速度大于操作线速度大于500 cm/h流流通通色色谱谱柱效柱效n色色谱谱柱效的普遍化公式为柱效的普遍化公式为n在在u 很大时，很大时，n其中其中n因此因此CuBuAHETPepDudCCuHETP222pporepporeeduduDDpporepdCuudCHETP流流通通色色谱谱介质制备介质制备 p294nPOROS流通流通色色谱谱介质介质 该制备方法是首先合成微球，然后通过聚集形成聚集体，该制备方法是首先合成微球，然后通过聚集形成聚集体，最终经聚集体的再聚合形成所需粒径的分离介质最终经聚
50、集体的再聚合形成所需粒径的分离介质n联合致孔法联合致孔法 通过固、液联合致孔方法合成双分散孔型层析介质，该方法通过固、液联合致孔方法合成双分散孔型层析介质，该方法适用范围广，合成方法简单；适用范围广，合成方法简单；n连续床连续床色色谱谱介质介质 以以色色谱谱柱为模具，在柱内原位合成多孔型聚合物单块，再柱为模具，在柱内原位合成多孔型聚合物单块，再经适当的功能基化可用于分离经适当的功能基化可用于分离POROS流通流通色色谱谱介质介质流流通通色色谱谱介质制备（介质制备（2）B. 双孔微球（BiPB） A. 微孔微球（MiPB）（孔径10-100 nm） 荧光标记琼脂糖吸附剂的激光扫描共聚焦显微镜 0
51、.20.40.60.8105101520u (cm/min)HETP (cm)HA-DEAESA-DEAEHETPvs.流速双峰孔径分布，为10100nm和5003000nm高流速（40cm/min）下BiPB的动态容量和柱效约为MiPB的3倍琼脂糖大孔介质孔扩散系数提高1倍，静态容量提高40，动态容量提高50在518cm/min的范围内柱效与流速无关，适合高速色谱分离蛋白质。流通流通色色谱谱连续床优点连续床优点n连续床在柱内原位合成制备，避免了传统的连续床在柱内原位合成制备，避免了传统的颗粒填充床颗粒制备和层析柱的填充过程；颗粒填充床颗粒制备和层析柱的填充过程；n连续床介质在层析柱内为多孔型
52、连续相，孔连续床介质在层析柱内为多孔型连续相，孔径在径在亚微米及微米级亚微米及微米级之间，在中、低压力下之间，在中、低压力下液体可高速通过连续床孔隙，液体可高速通过连续床孔隙，两相间发生对两相间发生对流传质流传质；n连续床介质为连续相，内部孔隙率连续床介质为连续相，内部孔隙率可达可达0.8以以上上，提高了层析柱的有效利用空间。，提高了层析柱的有效利用空间。置换置换色色谱谱学习要点学习要点 p296n理解理解：置换色谱技术的原理及操作，：置换色谱技术的原理及操作，n应用应用：了解置换色谱技术的应用范围及优缺点：了解置换色谱技术的应用范围及优缺点 置换置换色色谱谱置换置换色色谱谱原理原理 p297
53、n置换置换色色谱谱基于置换剂与吸附质间在吸附剂表面的基于置换剂与吸附质间在吸附剂表面的竞竞争性吸附争性吸附；n载液平衡的层析柱添加一定量料液，料液中溶质吸载液平衡的层析柱添加一定量料液，料液中溶质吸附于入口处。附于入口处。n连续输入含有置换剂的溶液，置换剂与固定相表面连续输入含有置换剂的溶液，置换剂与固定相表面结合位点的亲和力比料液中的各组分都要高，其与结合位点的亲和力比料液中的各组分都要高，其与料液中各组分竞争固定相的结合位点，将吸附的溶料液中各组分竞争固定相的结合位点，将吸附的溶质置换下来；质置换下来；n同样，吸附作用强的溶质也会竞争吸附作用弱溶质同样，吸附作用强的溶质也会竞争吸附作用弱溶
54、质所占据的位点，推动其向出口移动；所占据的位点，推动其向出口移动；置换置换色色谱谱置换置换色色谱谱原理（原理（2）n在在优惠吸附优惠吸附系统中，如果系统中，如果色色谱谱柱足够长，各组分按柱足够长，各组分按其与固定相亲和力的大小顺序形成彼此相连的其与固定相亲和力的大小顺序形成彼此相连的纯组纯组分区带分区带；n由于置换剂的由于置换剂的移动速度一定移动速度一定，故各组分区带的移动，故各组分区带的移动速度也为定值，形成速度也为定值，形成“等速置换列等速置换列”；n如果一种组分由于某种原因进入到如果一种组分由于某种原因进入到置换置换色色谱谱置换置换色色谱谱原理示意原理示意 p298置换置换色色谱谱置换置
55、换色色谱谱特点特点 p303n与一般的洗脱与一般的洗脱色色谱谱经常出现的经常出现的拖尾现象拖尾现象相比，置换列中各溶相比，置换列中各溶质区带的边界陡直，因此置换层析的质区带的边界陡直，因此置换层析的分辨率高分辨率高；n置换置换色色谱谱具有浓缩作用具有浓缩作用，并可通过调节置换剂浓度控制分，并可通过调节置换剂浓度控制分离产品的浓度，处理量大，并特别适用于处理稀料液；离产品的浓度，处理量大，并特别适用于处理稀料液；n置换列中各组分区带紧密相连，层析柱置换列中各组分区带紧密相连，层析柱利用率高利用率高，流动相，流动相用量少；用量少；n与亲和与亲和色色谱谱专一性纯化单一目标产物相比，置换层析同时实专一性纯化单一目标产物相比，置换层析同时实现多个目标产物的分离纯化，现多个目标产物的分离纯化，适于含有多个目标产物料适于含有多个目标产物料液的分离液的分离；n与梯度洗脱与梯度洗脱色色谱谱相比，置换相比，置换色色谱谱过程中料液、置换剂和再生过程中料液、置换剂和再生剂均以简单阶跃函数的形式输入，剂均以简单阶跃函数的形式输入，容易进行连续色谱分容易进行连续色谱分离离；
