第11章 DNA文库的构建和目标基因的筛选

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1、洛阳洛阳师范师范学院学院生命科学系生命科学系 韩建明韩建明基基 因因 工工 程程洛阳洛阳师范师范学院学院生命科学系生命科学系 韩建明韩建明基基 因因 工工 程程洛阳洛阳师范师范学院学院生命科学系生命科学系 韩建明韩建明基基 因因 工工 程程洛阳洛阳师范师范学院学院生命科学系生命科学系 韩建明韩建明基基 因因 工工 程程洛阳洛阳师范师范学院学院生命科学系生命科学系 韩建明韩建明基基 因因 工工 程程基因文库基因文库(gene library)： 指某一生物分离的全部基因的集合。指某一生物分离的全部基因的集合。基因组基因组DNA文库：文库： 指将是指某个生物的基因组指将是指某个生物的基因组DNAD

2、NA与适当的载体在体外重与适当的载体在体外重组后，转化宿主细胞，通过筛选后得到大量的阳性菌落组后，转化宿主细胞，通过筛选后得到大量的阳性菌落( (或或噬菌体噬菌体) )，所有菌落或噬菌体的集合即为该生物的基因文库，所有菌落或噬菌体的集合即为该生物的基因文库。cDNA文库：文库： 指某生物某一发育时期、某一组织或某种环境条件下所指某生物某一发育时期、某一组织或某种环境条件下所转录的转录的mRNA经逆转录形成的经逆转录形成的cDNA片段与载体连接转化受片段与载体连接转化受体细胞而形成的克隆的集合。体细胞而形成的克隆的集合。洛阳洛阳师范师范学院学院生命科学系生命科学系 韩建明韩建明基基 因因 工工

3、程程噬噬菌菌斑斑菌菌落落洛阳洛阳师范师范学院学院生命科学系生命科学系 韩建明韩建明基基 因因 工工 程程第一节第一节 基因组基因组DNADNA文库的构建文库的构建第二节第二节 cDNAcDNA基因文库的构建基因文库的构建第三节第三节 基因克隆的筛选策略基因克隆的筛选策略第四节第四节 DNADNA文库的保存文库的保存 洛阳洛阳师范师范学院学院生命科学系生命科学系 韩建明韩建明基基 因因 工工 程程8第一节第一节 基因组基因组DNADNA文库的构建文库的构建一、基因组一、基因组DNA文库的类型文库的类型1、质粒文库：、质粒文库：容纳片段小于容纳片段小于10kb，以菌落的形式保存和筛选，以菌落的形式

4、保存和筛选，一般用于对大片段文库的亚克隆，用于鸟枪法测序等。一般用于对大片段文库的亚克隆，用于鸟枪法测序等。2、噬菌体文库：、噬菌体文库：一般用一般用噬菌体载体，插入型容纳片段小于噬菌体载体，插入型容纳片段小于7kb，适合于构建，适合于构建cDNA文库，置换型容纳文库，置换型容纳9-25kb，适合于，适合于构建亚克隆文库或直接构建基因组文库。构建亚克隆文库或直接构建基因组文库。洛阳洛阳师范师范学院学院生命科学系生命科学系 韩建明韩建明基基 因因 工工 程程95、亚基因组文库：、亚基因组文库：文库的对象只是基因组的一部分，可用染文库的对象只是基因组的一部分，可用染色体显微切割、特定色体显微切割、

5、特定YAC富集等方法而产生，用于针对特定富集等方法而产生，用于针对特定目标基因对大片段文库的深入研究。目标基因对大片段文库的深入研究。4、人工染色体文库：、人工染色体文库：BAC、YAC、PAC等文库，最大插入片等文库，最大插入片段分别为段分别为300kb、1000kb和和150kb，是大片段文库，主要用，是大片段文库，主要用于基因组测序和图谱构建。于基因组测序和图谱构建。6、基因组文库的发展：略、基因组文库的发展：略3、粘粒文库：、粘粒文库：一般用于直接构建基因组文库，最长插入片段一般用于直接构建基因组文库，最长插入片段比比噬菌体文库略长，达噬菌体文库略长，达45kb左右。左右。洛阳洛阳师范

6、师范学院学院生命科学系生命科学系 韩建明韩建明基基 因因 工工 程程10二、文库的代表性和随机性二、文库的代表性和随机性 为保证能从基因组文库中筛选到某个特定的基因，基因为保证能从基因组文库中筛选到某个特定的基因，基因组文库必须有一定的代表性和随机机。组文库必须有一定的代表性和随机机。洛阳洛阳师范师范学院学院生命科学系生命科学系 韩建明韩建明基基 因因 工工 程程11代表性：指文库中所有克隆所携带的代表性：指文库中所有克隆所携带的DNA片段重新组合起来可片段重新组合起来可 以覆盖整个基因组，即可以从该文库中分离任何一段以覆盖整个基因组，即可以从该文库中分离任何一段DNA。 代表性代表性意味着文

7、库要有意味着文库要有完备性，完备性，是指在构建的基因文库是指在构建的基因文库中任一基因存在的概率。中任一基因存在的概率。 它与基因文库最低所含克隆数它与基因文库最低所含克隆数N之间的关系可用下式表示：之间的关系可用下式表示： N = ln ( 1 P ) / ln ( 1 f )。P ： 任一基因被克隆（或存在于基因文库中）的概率任一基因被克隆（或存在于基因文库中）的概率f ：克隆片段的平均大小：克隆片段的平均大小 / 生物基因组的大小生物基因组的大小 。例：假如重组片段大小为例：假如重组片段大小为20kb，要使文库包含该基因组任一片，要使文库包含该基因组任一片段的概率达到段的概率达到99%，

8、则，则N(E. coli)=ln(1-0.99)/ln(1-20/4600)=1057N(人人)=ln(1-0.99)/ln(1-20/(3109)=6.9105洛阳洛阳师范师范学院学院生命科学系生命科学系 韩建明韩建明基基 因因 工工 程程随机性：随机性： 既表示构建文库时要从基因组既表示构建文库时要从基因组DNA获得随机断裂的片段，获得随机断裂的片段，也表示构建好的文库中所有基因要有相等的筛选概率。也表示构建好的文库中所有基因要有相等的筛选概率。洛阳洛阳师范师范学院学院生命科学系生命科学系 韩建明韩建明基基 因因 工工 程程基因文库的质量标准基因文库的质量标准 除了尽可能高的完备性外，一个

9、理想的基因文库应具备除了尽可能高的完备性外，一个理想的基因文库应具备下下列条件列条件： 1 1、重组克隆的总数不宜过大，以减轻筛选工作的压力；重组克隆的总数不宜过大，以减轻筛选工作的压力； 2 2、载体的装载量最好大于基因的长度，避免基因被分隔克隆；载体的装载量最好大于基因的长度，避免基因被分隔克隆； 3 3、克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域，以利于克隆克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域，以利于克隆排序和染色全步查；排序和染色全步查； 4 4、克隆片段易于从载体分子上完整卸下进行亚克隆；克隆片段易于从载体分子上完整卸下进行亚克隆； 5、重组克隆能稳定保存、扩增和筛选，文库繁殖后失

10、真度小。重组克隆能稳定保存、扩增和筛选，文库繁殖后失真度小。洛阳洛阳师范师范学院学院生命科学系生命科学系 韩建明韩建明基基 因因 工工 程程 1基因组基因组DNA文库的载体制备文库的载体制备 载体的好坏是影响连接成功与否的关键，载体的制备载体的好坏是影响连接成功与否的关键，载体的制备要求两点，一是纯度高；二是去磷酸化好。要求两点，一是纯度高；二是去磷酸化好。三、基因组三、基因组DNA文库的构建流程文库的构建流程 2高质量大相对分子量基因组高质量大相对分子量基因组DNA的提取和部分酶切的提取和部分酶切 构建不同大小插入片段的基因组文库对构建不同大小插入片段的基因组文库对DNA相对分子相对分子质量

11、要求不同，一般所提取的质量要求不同，一般所提取的DNA分子量至少应该是文库分子量至少应该是文库最终平均插入片段长度的最终平均插入片段长度的35倍。倍。 洛阳洛阳师范师范学院学院生命科学系生命科学系 韩建明韩建明基基 因因 工工 程程 3外源外源DNA的连接转化或包装侵染的连接转化或包装侵染 一般在构建大片段基因组一般在构建大片段基因组DNA文库时，大量连文库时，大量连接前都要先使用小体系连接来寻找最适的比例。接前都要先使用小体系连接来寻找最适的比例。在电转化和包装侵染过程中，首先最好选择转化在电转化和包装侵染过程中，首先最好选择转化效率高的感受态细胞和最佳的转化条件或效价高效率高的感受态细胞和