第二章基因工程的载体和工具酶

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1、第二章第二章 基因工程的基因工程的载体和工具酶载体和工具酶第一节第一节 载载 体体载体必须是复制子。载体必须是复制子。基因克隆的目的基因克隆的目的是使目的基因在特定的条件下得到是使目的基因在特定的条件下得到扩增和表达扩增和表达，而目的基因本身无法进行复制和表达、，而目的基因本身无法进行复制和表达、不易进入受体细胞、不能稳定维持，所以就必须借不易进入受体细胞、不能稳定维持，所以就必须借助于助于“载体载体”及其及其“寄主细胞寄主细胞”来实现来实现作为基因克隆的载体必须具备以下特性作为基因克隆的载体必须具备以下特性具有合适的筛选标记，便于重组子的筛选。具有合适的筛选标记，便于重组子的筛选。具备多克隆

2、位点（具备多克隆位点（MCS），便于外源基因插入。），便于外源基因插入。自身分子量较小，拷贝数高。自身分子量较小，拷贝数高。在宿主细胞内稳定性高。在宿主细胞内稳定性高。（一）质粒载体的生物学特性（一）质粒载体的生物学特性（二）质粒载体的制备（二）质粒载体的制备 （三）质粒载体的改造（三）质粒载体的改造（四）几个常用质粒载体（四）几个常用质粒载体一一 质粒载体（质粒载体（plasimid vectorsplasimid vectors）（1）质粒质粒是是独立于染色体以外的能自主复制的裸露的双链环状独立于染色体以外的能自主复制的裸露的双链环状( (少数为线形和少数为线形和RNARNA） DNADN

3、A分子。分子。（一）质粒的生物学特性（一）质粒的生物学特性（一）质粒的生物学特性（一）质粒的生物学特性（2）质粒的大小质粒的大小差异很大差异很大，最小的只有，最小的只有1kb,只能编码中等大只能编码中等大 小的小的2-3种蛋白质分子，最大的达到种蛋白质分子，最大的达到200kb。（3）质粒的生存质粒的生存在寄主细胞中在寄主细胞中“友好友好”地地“借居借居”，离开了，离开了寄主寄主 它本身无法复制；同时质粒往往有宿主专一性，如大肠它本身无法复制；同时质粒往往有宿主专一性，如大肠 杆菌的复制起点不一定能在其它生物细胞中繁殖。杆菌的复制起点不一定能在其它生物细胞中繁殖。（一）质粒的生物学特性（一）质

4、粒的生物学特性（4）质粒的复制类型质粒的复制类型（5）质粒的不亲和性质粒的不亲和性根据拷贝数将质粒分为两种复制型：根据拷贝数将质粒分为两种复制型：“严紧型严紧型”质粒质粒（stigent plasmid），），拷贝数为拷贝数为1-3；“松弛型松弛型”质粒质粒（relaxed plasmid），），拷贝数为拷贝数为10-60。不过即使是同一质粒，其拷贝数在不同的寄主细胞间和不同不过即使是同一质粒，其拷贝数在不同的寄主细胞间和不同的生长环境也可能有很大的变化。的生长环境也可能有很大的变化。两种亲缘关系密切的不同质粒不能在同一宿主细胞中稳定共两种亲缘关系密切的不同质粒不能在同一宿主细胞中稳定共存。载

5、体质粒与受体的质粒应是不同的不亲和群。存。载体质粒与受体的质粒应是不同的不亲和群。一种质粒在宿主细胞中存在的数目称为该质粒的一种质粒在宿主细胞中存在的数目称为该质粒的拷贝数拷贝数。接合型质粒接合型质粒分子量大分子量大严紧型复制严紧型复制 非接合型质粒非接合型质粒分子量小分子量小松弛型复制松弛型复制 是否含有接是否含有接合转移基因合转移基因 非转移性质粒，不含非转移性质粒，不含tra基因；可以为转基因；可以为转移性质粒所带动转移。移性质粒所带动转移。转移性质粒，含有转移性质粒，含有tra基因；能通过结合基因；能通过结合作用从一个细胞转移到另一个细胞。作用从一个细胞转移到另一个细胞。在一般情况下，

6、质粒的接合转移能力与分子大小及复制型间在一般情况下，质粒的接合转移能力与分子大小及复制型间有一定的相关性。现归纳如下：有一定的相关性。现归纳如下：（一）质粒的生物学特性（一）质粒的生物学特性 质粒的转移质粒的转移 （7）质粒的存在形式质粒的存在形式有超螺旋、开环双螺旋和线状双有超螺旋、开环双螺旋和线状双螺旋三种螺旋三种 双螺旋共价闭合双螺旋共价闭合环（环（SC构型）构型）开环双螺旋开环双螺旋（OC构型）构型）线状双螺旋线状双螺旋（L构型）构型）（一）质粒的生物学特性（一）质粒的生物学特性（二）质粒（二）质粒DNADNA的制备的制备目前一般使用碱变性法制备质粒目前一般使用碱变性法制备质粒DNA。

7、这个方法主要包括。这个方法主要包括培养收集细菌菌体，裂解细胞，将质粒培养收集细菌菌体，裂解细胞，将质粒DNA与染色体与染色体DNA分开及除去蛋白质和分开及除去蛋白质和RNA。分离质粒的方法有多种，如碱裂解法、煮沸裂解法、层析分离质粒的方法有多种，如碱裂解法、煮沸裂解法、层析柱过滤法等。柱过滤法等。碱变性法质粒提取的原理碱变性法质粒提取的原理 通过冷却或恢复中性通过冷却或恢复中性pH值使之复性，线性染色体形成值使之复性，线性染色体形成网状结构，而网状结构，而cccDNA可以准确迅速复性，通过离心去除线可以准确迅速复性，通过离心去除线性染色体，获得含有性染色体，获得含有cccDNA的上清液，最后用

8、乙醇沉淀，的上清液，最后用乙醇沉淀，获得质粒获得质粒DNA。 在在pH值值12.012.5范围内时，线性的范围内时，线性的DNA会被变性而共会被变性而共价闭合环状质粒价闭合环状质粒DNA却不会被变性。却不会被变性。碱裂解法提取质粒碱裂解法提取质粒1 1 挑取挑取LBLB固体培养基上生长的单菌落，接种于固体培养基上生长的单菌落，接种于3.0ml LB3.0ml LB（含相（含相应抗生素）液体培养基中，应抗生素）液体培养基中，3737、250rpm250rpm振荡培养过夜（约振荡培养过夜（约16-17hr16-17hr）。）。2 2 取取1.5ml1.5ml培养物入微量离心管中，室温离心培养物入微

9、量离心管中，室温离心12000rpm12000rpm，1min1min， 弃上清弃上清3 3 将细菌沉淀重悬于将细菌沉淀重悬于100l100l预冷的溶液预冷的溶液中，重悬，使菌体分中，重悬，使菌体分 散混匀散混匀4 4 加加200l200l新鲜配制的溶液新鲜配制的溶液，颠倒数次混匀（不要剧烈振，颠倒数次混匀（不要剧烈振 荡），并将离心管放置于冰上荡），并将离心管放置于冰上2-3min2-3min，使细胞膜裂解（溶液，使细胞膜裂解（溶液 为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清）为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清）5 5 加入加入150l150l预冷的溶液预冷的溶液，将管温和颠倒数次混匀，见白色，将管温和

10、颠倒数次混匀，见白色 絮状沉淀，可在冰上放置絮状沉淀，可在冰上放置3-5min3-5min。6 6加入加入450l450l的苯酚的苯酚/ /氯仿氯仿/ /异戊醇，振荡混匀，异戊醇，振荡混匀，44离心离心 12000g 12000g 10min 10min7 7 小心移出上清于一新微量离心管中，加入小心移出上清于一新微量离心管中，加入2.52.5倍体积预冷的倍体积预冷的 无水乙醇，混匀，室温放置无水乙醇，混匀，室温放置2-5min2-5min，44离心离心12000g12000g15min15min8 1ml8 1ml预冷的预冷的70%70%乙醇洗涤沉淀乙醇洗涤沉淀1-21-2次，次，44离心离

11、心8000g8000g10min10min， 弃上清，将沉淀在室温下晾干弃上清，将沉淀在室温下晾干9 9 沉淀溶于沉淀溶于20l TE20l TE（含（含RNase A 20g/mlRNase A 20g/ml），），3737水浴水浴 30min 30min以降解以降解RNARNA分子，分子，-20-20保存备用。保存备用。溶液溶液 I50 mM50 mM葡萄糖葡萄糖 / 25 mM Tris-/ 25 mM Tris-H HCl / 10 mM EDTACl / 10 mM EDTA，pH 8.0pH 8.0Tris-HClTris-HCl控制溶液的控制溶液的pHpH葡萄糖使悬浮后的大肠杆菌