微生物限度检查法
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1、微生物限度检查法1范围本标准适用于非规定灭菌制剂及其原料、辅料检查项目包括细菌数、霉菌及酵母菌数、控制菌检查及活螨的检查。2依据标准中华人民共和国药典药品微生物学检验手册YBB00132002药品包装用复合膜、袋通则3 人员资质及培训3.1 从事药品微生物检验工作的负责人应具备微生物学或相近专业知识的教育背景。3.2 检验人员应依据所在岗位和职责接受相应的培训，在确认可以承担某一试验前，不能独立从事该项微生物试验。应保证所有人员在上岗前接受胜任工作所必需的设备操作、微生物检验技术和实验室生物安全等方面的培训，经考核合格后方可上岗，同时，实验室应制定所有级别实验人员的继续教育计划。3.3 检验人
2、员必须熟悉相关检验方法、程序、检测目的和结果评价。3.4 实验室应通过参加内部质量控制、能力验证或使用标准菌株等方法客观评价检验人员的能力，必要时对其进行再培训并重新评估。当使用一种非经常使用的方法或技术时，有必要在检测前确认微生物检测人员的操作技能。 4 培养基4.1 培养基的制备4.1.1 培养基可按处方配制。也可使用按处方生产的符合规定的脱水培养基。4.1.2 在制备培养基时，应选择质量符合要求的脱水培养基或单独配方组分进行配制。脱水培养基应附有处方和使用说明，配制时应按使用说明上的要求操作以确保培养基的质量符合要求，不得使用结块或颜色发生改变的脱水培养基。4.1.3 脱水培养基或单独配
3、方组分应在适当的条件下贮藏，如低温、干燥和避光，所有的容器应密闭，尤其是盛放脱水培养基的容器。商品化的成品培养基除了应附有处方和使用说明外，还应注明有效期、贮藏条件、适用性检查试验的质控菌和用途。4.1.4 为保证培养基质量的稳定可靠，各脱水培养基或各配方组分应准确称量，并要求有一定的精确度。配制培养基最常用的溶剂是纯化水，特殊情况下，可能需要去离子水和蒸馏水。应记录各称量物的重量和水的使用量。4.1.5 配制培养基所用容器和配套器具应洁净，可用纯化水冲洗玻璃器皿以消除清洁剂和外来物质的残留。对热敏感的培养基如糖发酵培养基其分装容器一般应预先进行灭菌，以保证培养基的无菌性。4.1.6 脱水培养
4、基应完全溶解于水中，再进行分装和灭菌。配制时若需要加热助溶，应注意不要过度加热，以避免培养基颜色变深。如需要添加其它组分时，加入后应充分混匀。4.1.7 应按照生产商提供或使用者验证的参数进行培养基的灭菌。培养基灭菌一般采用湿热灭菌技术，特殊培养基可采用薄膜过滤法除菌。培养基灭菌程序应采用验证的灭菌程序灭菌，培养基灭菌方法和条件，应通过无菌性和促生长试验进行验证。此外，对高压灭菌器的蒸汽循环系统也要加以验证，以保证在一定装载方式下的正常热分布，温度缓慢上升的高压灭菌器可能导致培养基的过热，过度灭菌可能会破坏大多数的细菌和真菌培养基促生长的质量。灭菌器中培养基的容积和装载方式也将影响加热的速度。
5、因此，应根据灭菌培养基的特性，进行全面的灭菌程序验证。4.1.8 应确定每批培养基灭菌后的pH值（冷却至室温25测定）。若培养基处方中未列出pH值的范围，除非经验证表明培养基的pH值允许的变化范围很宽，否则，pH值的范围不能超过规定值±0.2。4.1.9 制成平板或分装于试管的培养基应进行下列检查：容器和盖子不得破裂，装量应相同，尽量避免形成气泡，固体培养基表面不得产生裂缝和涟漪，在冷藏温度下不得形成结晶，不得污染微生物等。应记录批数量、有效期，并进行培养基的无菌检查。4.2 培养基的贮藏4.2.1 自制的培养基应标记名称、批号、配置日期等信息，并在已验证的条件下贮藏。商品化的成品培
6、养基标签上应标有名称、批号、生产日期、失效期及培养基的有关特性，生产商和使用者应根据培养基使用说明书上的要求进行贮藏，所使用的贮藏和运输条件应使成品培养基最低限度的失去水分并提供机械保护。4.2.2 培养基应避光保存，若要长期保存，应置于密闭容器中以防止水分流失。琼脂平板最好现配现用，如置冰箱保存，一般不超过1周，且应密闭包装，若延长保存限期，保存期需经验证确定。4.2.3 固体培养基灭菌后的再融化只允许1次，以避免因过度受热造成培养基质量下降或微生物污染。培养基的再融化一般采用水浴或流通蒸汽加热。若使用微波炉，应避免培养基过度受热及水分的蒸发，更要注意安全。融化的培养基应置4550的水浴中，
7、不得超过8小时。倾注培养基时，应擦干培养基容器外表面的水分，避免容器外壁的水滴进行培养基中造成污染。4.2.4 使用过的培养基（包括失效的培养基）应与未使用的培养基分开摆放，并按照规定程序及时进行处理。4.3 培养基的质量控制试验4.3.1 所有配制好的培养基均应进行质量控制试验。实验室配制的培养基的常规监控项目是pH、适用性检查试验，定期的稳定性检查以确定有效期。培养基在有效期内应依据适用性检查试验确定培养基质量是否符合要求。有效期的长短将取决于在一定存放条件下（包括容器特性及密闭性）的培养基其组分的稳定性。4.3.2 除另有规定外，在实验室中，若采用已验证的配制和灭菌程序制备培养基且过程受
8、控，那么同一批脱水培养基的适用性检查试验可只进行一次。如果培养基的制备过程未经验证，那么每一批培养基培养基均要进行适用性检查试验，试验的菌种可根据培养基的用途从相关附录中进行选择，也可增加从生产环境及产品中常见的污染菌株。4.3.3 培养基的质量控制试验若不符合规定，应寻找不合格的原因，以防止问题重复出现。任何不符合要求的培养基均不能使用。5 菌种5.1 药品微生物检验用的试验菌应来自认可的国内或国外菌种保藏机构的标准菌株，或使用与标准菌株所有相关特性等效的商业派生菌株。5.2 标准菌株的复活或培养物的制备应按供应商提供的说明或按已验证的方法进行。从国内或国外菌种保藏机构获得的标准菌株经过复活
9、并在适宜的培养基生长后，即为标准储备菌株。标准储备菌株应进行纯度和特性确认。标准储备菌株保存时，可将培养物等份悬浮于抗冷冻的培养基中，并分装于小瓶中，建议采用低温冷冻干燥、液氮贮存、超低温冷冻（低于-30）等方法保存。低于-70或低温冷冻干燥方法可延长菌种保存时间。标准储备菌株可用于制备每月或每周1次转种的工作菌株。冷冻菌种一旦解冻转种制备工作菌株后，不等重新冷冻和再次使用。5.3 工作菌株的传代次数应严格控制，不得超过5代（从菌种保藏机构获得的标准菌株为第0代），以防止过度的传代增加菌种变异的风险。1代是指将活的培养物接种到微生物生长的新鲜培养基中培养，任何亚培养的形式均被认为是转种或传代1
10、次。必要时，实验室应对工作菌株的特性和纯度进行确认。5.4 工作菌株不可替代标准菌株，标准菌株的商业衍生物仅可用作工作菌株。5.5 实验室必须建立和保存其所有菌株的进出、收集、贮藏、确认试验以及销毁的记录，应有菌种管理的程序文件（从标准菌株到工作菌株），该程序包括：标准菌株的申购记录；从标准菌株到工作菌株操作及记录；菌种必须定期转种传代，并做纯度、特性等实验室所需关键指标的确认，并记录；每支菌种都应注明其名称、标准号、接种日期、传代数；菌种生长的培养基和培养条件；菌种保藏的位置和条件；其他需要的文件。6 微生物限度检验实验室6.1 微生物限度检查的全过程，均应遵守无菌操作，严防再污染。因此，微
11、生物限度检查通常应在环境洁净度C级下的局部A级的单向流空气区域内进行；限度检查实验室应配有相应的人流和物流缓冲间或传递窗（柜）。应按相关并定期按医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法的现行国家标准进行洁净度验证和日常监测。6.2 实验室对所有的消毒剂种类应定期更换，使用的消毒剂应无菌。6.3 注意进出洁净区时，相邻两门不能同时打开，并在人流和物流通道房间增加气锁。7 设备7.1 实验室配备与检验能力和工作量相适应的仪器设备，其类型、测量范围和准确度等级应满足检验所采用标准的要求，设备的安装和布局应便于操作，易于维护、清洁和校准。7.2 实验室在仪器设备完成相应的检定、校准、验证
