15-13602 猴痘病毒中非株探针法qPCR试剂盒使用手册使用手册V1.0

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1、天净沙系列CAT#:15-13602低温运输，-20保存猴痘病毒中非株探针法qPCR试剂盒Monkeypox Virus Central African Strain Probe PCR Kit使用手册V1.0江苏天净沙基因诊断技术有限公司网址：；电话：400-6005850；电邮：order产品及特点猴痘病毒（Monkeypox Virus）属正痘病毒属，可在非洲绿猴肾细胞中培养生长，导致细胞病变。人类感染猴痘，主要通过被已感染的动物咬伤，或直接接触被感染动物的血液、体液、猴痘病损而受染；通常由动物传给人，偶也可以发生人到人的猴痘传播。一般认为是在直接的、长时间面对面的接触中，通过含毒的大量

2、呼吸飞沫而传播。猴痘还可以通过直接接触感染者的体液或病毒污染的物品（如衣服和被褥）而传播。主要临床症状为发热、剧烈头痛、淋巴结肿大、背痛、肌肉痛（肌肉疼痛）以及倍感无力（精神不振）。猴痘病毒有两个主要毒株：中非（刚果盆地）株和西非株。前者死亡率高达10%，而西非株的致死率约为1%，因此快速检测猴痘病毒中非株具有重要的意义。本产品就是以探针法qPCR技术为基础开发的专门检测猴痘病毒中非株的试剂盒，它具有下列特点：1. 即开即用，用户只需要提供样品DNA模板。2. 引物和探针经过优化，分析灵敏性高，可以达到100拷贝/L。3. 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。4. 特异性高，引物是根据猴痘病毒中

3、非株DNA高度保守区设计，不会跟其他生物的DNA发生交叉反应。5. 既可用于定性检测，又可用于定量检测。用于定量检测时线性范围至少为5个数量级。6. 本产品足够50次20L体系的探针法荧光定量PCR反应。7. 本产品只能用于科研。规格及成分本产品采用五孔盒包装成分编号规格包装材料2×Probe qPCR MasterMix9812010.5 mL0.5mL本色盖荧光PCR专用模板稀释液1807011 mL1.5mL绿盖管超纯水2108061 mL1.5mL蓝盖管猴痘病毒中非株qPCR引物-探针混合液yp15-13602150 L0.5mL棕色管猴痘病毒中非株qPCR阳性对照(1

4、15;10E7拷贝/L)pc1360250 L0.5mL黄盖管使用手册15-13602sc1份无运输及保存低温运输，-20保存，保存期限为12个月。自备试剂样品DNA。使用方法一、稀释标准曲线样品（以10E1-10E6拷贝/L这6个10倍稀释度为例）。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的DNA片段作为阳性对照。1. 标记6个离心管，分别为6，5，4，3，2，1。2. 用带芯枪头分别加入45 L荧光PCR专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同）。3

5、. 在6号管中加入5 L 1×10E7拷贝/L 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×10E6拷贝/L的标准曲线样品。放冰上待用。4. 换枪头，在5号管中加入5 L 1×10E6拷贝/L 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E5拷贝/L的标准曲线样品。放冰上待用。5. 换枪头，在4号管中加入5 L 1×10E5拷贝/L 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E4拷贝/L的标准曲线样品。放冰上待用。6. 重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。二、样品DNA的制备7. 如果

6、有N个样品，最好设置N+2个提取，多出的一个是PC（样品制备阳性对照），一个是NC（样品制备阴性对照）。可以用10L上步所得4号稀释液再加上一定量的水使总体积跟核酸制备试剂盒所要求的起始样本体积一样，以此作为PC。另外用水作为NC。8. 用自选方法纯化样品的DNA，本试剂盒跟市场上大多数样品DNA提取试剂盒兼容。也可以选购本公司的免提取核酸释放剂。三、Probe qPCR反应（20L体系，在样品制备室进行）9. 如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照（用水做模板），6个用于标准曲线。如果做定性分析并且只做1次重复，

7、则标记N+4个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照（用水做模板），1个用于PCR阳性对照（直接用第6步第4号管的阳性对照稀释液做模板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。10. 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加）：成分样品管N+2个PCR阴性对照标准曲线样品管（1-6管）2×Probe qPCR MasterMix各10 L10 L各10 L猴痘病毒中非株qPCR引物-探针混合液各3 L3 L各3 L N+2个待测DNA样本各7 L不加不加超

8、纯水不加7 L不加第6步所得标准曲线样品稀释液（1-6号）不加不加各7L（2号样到2号管，3号样到3号管）11. 盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR：过程温度时间预变性952 minPCR反应（45个循环）9515 sec5830 sec（采集FAM通道的荧光信号，设置BHQ-1为淬灭基团）五、数据处理12. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值，再推算出其浓度。13. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照必须无Ct或Ct大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于40，否则实验无效。如果实验有效，则分析待测样品，如果无Ct或Ct大于或等于40，则为阴性。如果Ct小于40则为阳性。关联产品猴痘病毒中非株荧光及可视化LAMP检测试剂盒20220524dx