试管凝集反应

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1、试管凝集反应Agglutination in Test Tubes凝集反应(agglutination) 是一种经典的血清学反应，它是指颗粒性抗原例如红细胞、细菌等与相应的抗体在适量的电解质存在的条件下，经一定时间后凝聚成肉眼可见的凝集物。参加反应的颗粒性抗原称为凝集原(agglutinogen)，抗体称为凝集素(agglutinin)。 根据凝集反应中抗原的性质，反应的方式又分为直接凝集反应(direct agglutination)和间接凝集反应(indirect agglutination)。 直接凝集反应有玻片法和试管法之分，而间接凝集反应则分为间接凝集抑制试验、反向间接凝集试验和协同

2、凝集反应。 由于抗原、抗体结合具有高度的特异性，所以常利用凝集反应协助传染病的诊断、流行病学调查以及微生物分类、遗传研究等诸多方面。抗原抗原- -抗体反应抗体反应概念：概念： 体内外发生的高度特异性结合反应，其结构基础体内外发生的高度特异性结合反应，其结构基础为抗原表位与抗体超变区抗原结合位点的结构互补。为抗原表位与抗体超变区抗原结合位点的结构互补。抗原抗体的检测方法抗原抗体的检测方法凝集反应（直接凝集、间接凝集）凝集反应（直接凝集、间接凝集）沉淀反应（单向免疫扩散、双向免疫扩散、对流免沉淀反应（单向免疫扩散、双向免疫扩散、对流免 疫电泳、火箭电泳、免疫电泳、免疫比浊）疫电泳、火箭电泳、免疫电

3、泳、免疫比浊）补体参与反应补体参与反应标记技术（免疫荧光法、酶免疫测定、放射免疫测标记技术（免疫荧光法、酶免疫测定、放射免疫测定、化学发光免疫法、免疫印迹法）定、化学发光免疫法、免疫印迹法） 特 点：1.特异性，抗原-抗体的结合是特异性结合2.可逆性，抗原抗体结合是分子表面的非共价键结合3.阶段性，抗原抗体反应可分为两个阶段：1）特异性结合阶段；2）可见的反应阶段4.比例性，抗原和抗体结合是否呈现可见的反应现象与两者的分子比例密切相关抗原抗体比例对反应现象的影响抗原抗原- -抗体反应受多种因素影响抗体反应受多种因素影响1、电解质：抗原-抗体反应通常应用0.85%的氯化钠作为稀释液，以供给适应浓

4、度的电解质2、温度：通常在37oC水浴或孵育箱中进行3、酸碱度：抗原-抗体反应适应的酸碱度为pH6-8实验原理 定义定义: : 凝集反应凝集反应 分类分类: :直接凝集反应直接凝集反应: : 玻片凝集玻片凝集 试管凝集试管凝集间接凝集反应间接凝集反应可见的凝集团块可见的凝集团块颗粒性抗原颗粒性抗原相应抗体相应抗体+直接凝集反应直接凝集反应Direct agglutination 细菌、螺旋体或红细胞等颗粒性抗原，在适当电解质存在的条件下，可直接与相应的特异性抗体结合，出现凝集的现象，称为直接凝集反应（direct agglutination）。 有玻片法和试管法之分.indirect aggl

5、utination 间接凝集反应间接凝集反应可见的凝集团块可见的凝集团块颗粒性抗原颗粒性抗原相应抗体相应抗体+直接凝集反应直接凝集反应可溶性抗原可溶性抗原致敏颗粒致敏颗粒 相应抗体相应抗体+可见的凝集团块可见的凝集团块间接凝集反应间接凝集反应实验目的和要求掌握凝集反应的原理、方法、用途 实验原理： 试管凝集反应（agglutination in test tubes）是用已知颗粒性抗原检测未知抗体及其相对含量的半定量实验。 本实验是先在一系列试管内用生理盐水将待测血清进行连续倍比稀释，然后于各管中加入等量的已知颗粒性抗原悬液，使其与抗体充分混匀，静置一段时间后，观察各管有无凝集块，并根据凝集程

6、度判断待检血清中抗体的相对含量（效价）。试验也可在微量反应板上进行，成为微量反应法。实验材料：1、待检血清（制备的小鼠抗SRBC血清）：用生理盐水作1:20稀释2、 1 SRBC悬液3、生理盐水4、阳性对照溶血素（抗绵羊红细胞抗体，适当稀释1:1000）5、微量移液器、吸头、U型微量反应板（每人一块，要求洗净烘干，备用）、恒温培养箱等实验方法：1、在U型有机微量血凝板上预先做好标记；2、如图所示进行血清稀释和加样操作（每人一块血凝板）： 1）2-10、12号孔分别加入生理盐水50ul； 2）1、2号孔分别加入1:20稀释待检血清50ul，从2号孔开始进行血清倍比稀释，将2号孔的液体用移液器连续

7、吹吸3次，使其充分混匀，吸出50ul液体至3号孔，重复操作，直至10号孔，最终将10号孔的液体弃去50ul，保留50ul即可； 3）11号孔加入稀释好的阳性血清作为阳性对照，12号孔为阴性对照； 4）1-12号孔各加入1%SRBC 50ul，封口膜1-12孔封口，37温箱孵育1小时，室温放置15分钟，观察结果。123456789101112生理盐水(ul) 0 50 50 50 50 50待检血清(ul) 50 50 50 50 50 50血清稀释度 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:6401%SRBC(ul) 50 50 50 50 50 50血清最终稀释度 1:40

8、 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280生理盐水(ul) 50 50 50 50 50待检血清(ul) 50 50 50 50 阳性血清 50 血清稀释度 1:1280 1:2560 1:5120 1:10240 1%SRBC(ul) 50 50 50 50 50 50血清最终稀释度 1:2560 1:5120 1:10240 1:20480 弃去50ul实验加样孔底凝集现象 上清液 凝集程度全部凝集 澄清透明 + + + + （凝集块大，为最强凝集）大部分凝集 基本透明 + + + （凝集块较大，为强凝集）有明显凝集 半透明 + + （凝集块明显，为中度凝集）很少凝集 基

9、本混浊 + （凝集块不明显，为弱凝集）不凝集 混浊 （未见凝集块，为不凝集）实验结果判断孔底凝集块观察及结果判定结果判断l先观察生理盐水的对照孔12号孔，此孔不应发生血细胞凝集，液体混浊，管底沉淀物呈圆形，边缘整齐；l11号孔为阳性对照，应发生全部凝集，上清液澄清透明，管底可见大的凝集块；l然后再观察实验孔内液体浑浊度和孔底凝集块大小，依次判断其凝集程度；l凝集效价（血清凝集滴度）的判定：通常以能与一定量抗原发生肉眼可见的明显凝集（+）的血清最高稀释度为血清凝集效价。注意事项l做到加样取样的准确性；l做血清稀释时要逐管操作，防止跳管；l加入1%的SRBC时，要充分混匀，使加入到每孔中的SRBC的量尽可能一致；l观察结果时不要振摇微量血凝板，以免摇散凝聚物影响结果的判断；l判定血清凝集效价应以血清最终稀释度为准。