基因工程第九章重组DNA导入细胞

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1、第九章 重组DNA导入细胞Transferring DNA to cells转化 转导 转染 感染 结合 其它一、转化 transformation 一种遗传转移方式 1928年 Griffith 首次发现肺炎双球菌（Diplococcus pneumoniae）少量无毒RII（无荚膜，粗糙） 大量杀死有毒SIII（有荚膜，光滑）混合注射小白鼠小鼠死亡可分离出活SIII细胞RII细胞 + SIII DNA即一来自一个细菌细胞(供体)的DNA(片段)被另一个细胞(受体)所吸收(随后同受体染色体一起进行重组)对DNA的吸收，仅在受体生长周期中的一个短暂阶段。能够吸收DNA的细胞，称作感受态细胞(c

2、ompetent cell)肺炎链球菌产生的感受态因子能将感受态授于同一菌株的非感受态，而枯草芽胞杆菌的感受态因子似乎不能将感受态传给非感受态细胞。感受态因子可能是一种自溶酶(autolytic enzyme)，它能够产生或暴露结合DNA的受体位点感受态的确定似乎涉及某些胞内蛋白质的合成在肺炎链球菌和流感嗜血杆菌中，在最大感受态时期，群体中感受态细胞可达100%。在B. subtilis中感受态细胞的比例似乎不超过10-15% 在转化中有功能的DNA是双链或ssDNA， 线状或环状（一）CaCl2转化法 核心，目标细胞在CaCl2H2O溶液中浸泡一段时间 E.coli：100mME.coli:

3、 DH5, TG1, XL-1Blue, JM105吸附(adsorb)：感受态细胞和DNA混合，冰上30min 热激(heat shock)：42 90 sec恢复：12min复苏：37 150rpm摇床 45-60 min感受态细胞的保藏：10%甘油0.1M CaCl2 -70 Mg2+, Co2+, Ru2+ , DMSO二甲基亚砜等可提高效率转化效率107-109 cell/gDNA转化子（transformant）（二）原生质体转化法 protoplastG+细菌，特别是芽胞杆菌(bacillus)，酶母(yeast)Lysozyme / 等渗环境下，脱细胞壁细胞壁再生原生质体融合原

4、生质体融合(三)电转化法（electroporation）10%甘油(glycerol)或蔗糖(sucrose)，含(或不含)Mg2+ 离子2.5 KV/0.2cm 25F 200-400Gene Pulse, Bio-Rad 公司由噬菌体将细菌基因由一个细菌（供体）转移到另一个细菌（受体）的过程二、转导（transduction）（一）普遍性转导 (generalized transduction)phage在供体烈解中，部分供体DNA被包装，当感染受体菌时，若感染复数(multiplicity of infection)小于1时，缺陷phage可将供体DNA注入受体(此时原phage DN