核酸扩增技术(下)V.ppt

主要内容
第一节 聚合酶链反应
第二节 其他PCR相关技术
第三节 实时/荧光定量PCR技术
第四节 PCR产物分析
第一页，共八十五页。
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标准的PCR反应体系
总体积 X
A 0.1～1ug
B 各0.1～0.2umol/L
C 2.5u
D 各200umol/L
E 含 缓冲液 　 1.5 mmol/L
PCR扩增反应体系配制
第二页，共八十五页。
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PCR的程序编排与解读
1
2
3
4
5
22
55
72
94
时间（min）
温度
（℃）
D
3
B
1
C
2
重复 X 步
Y 轮
目的DN***段
扩增 Z 倍以上
A
第三页，共八十五页。
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第三节 实时/荧光定量PCR
在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法
Real-time /Fluorescence Quantitive Polymerase Chain Reaction
第四页，共八十五页。
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常规PCR技术：
对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析。无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测（开盖检测“气溶胶”污染问题）。
实时/荧光定量PCR技术：
利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析
实时/荧光定量PCR的优势
第五页，共八十五页。
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由于各反应管内PCR扩增效率的差异使得相同的样品扩增结果存在很大差异
同时扩增96份相同样品的Ct值一样，最终产物量却差异巨大
终点检测法定量的缺点
第六页，共八十五页。
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荧光定量PCR实时检测的优点
终产物量一样
起始量不同
第七页，共八十五页。
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普通和实时定量PCR的综合比较表
项 目
普通PCR
实时定量PCR
检测方法
终点检测
实时检测
准确性
差
好
重复性
差
好
安全性
低
高
通 量
低
高
价 格
便宜
昂贵
第八页，共八十五页。
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荧光染料法
SYBR green :特异性结合双链，释放荧光信号
荧光探针法
1.Taqman技术
2.molecular Beacon技术
3.复合探针法
一、荧光定量PCR荧光标记物
第九页，共八十五页。
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（一） 荧光染料法
SYBR荧光染料　SYBR荧光染料能特异性地掺入DNA双链，发出荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发出任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
此方法未使用目的特异性探针，其特异性完全由引物决定。在有非特异双链DNA产生时，其荧光也同样增强，此法与常规PCR的特异性差别不大。
第十页，共八十五页。
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