ELISA2-乙肝两对半5

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1、ELISA-2ELISA-2（乙肝两对半的检测）乙肝两对半的检测）临床免疫学教研室临床免疫学教研室邓念华邓念华【目的要求】1.掌握乙肝两对半的检测原理及操作过程；2.熟悉影响乙肝两对半检测的因素；3.进一步熟悉酶标仪及洗板机使用；4.了解乙肝两对半的临床意义。【原理】项 目表面抗原（HBsAg）表面抗体（抗-HBs）e抗原（HBeAg）抗e抗体（抗-HBe）核心抗体（抗-HBc）检 测 原 理双抗体夹心法双抗原夹心法双抗体夹心法竞争抑制法竞争抑制法【器材】SM-3型自动化酶免分析仪ZMX-988B型全自动酶标洗板机微量加样器吸头等 【试剂】HBsAgELISA试剂盒HBsAbELISA试剂盒H

2、BeAgELISA试剂盒HBeAbELISA试剂盒HbcAbELISA试剂盒【标本】待测血清 【操作步骤】1.准备：试剂盒各组份在37平衡30min；2.配洗涤液：用纯化水按1:25将浓缩洗液稀释；3.加样品：每孔加入待测样品75ul/孔，同时设置阳性对照、阴性对照，空白对照（不加样品），轻轻振荡混匀；4.孵育：贴上封膜，37反应60min;5.加酶结合物：每孔加入50ul/孔（空白对照不加），震荡10秒钟；表面抗原检测(双抗体夹心法)6.孵育：贴上封膜，37 反应30min;7.洗板：洗板机5次，最后一次尽量扣干；8.显色：先加显色液A 50ul，再加入显色液B 50ul，贴上封膜，37反应

3、30min(避光)； （注：显色从加入第一滴显色液B开始计时）9.终止：加终止液50ul；10.判读：终止反应后10min内完成。(450nm处测定吸光度)。结果判断及解释 COV=2.1OD阴性对照阳性：OD样品COV 阴性：OD样品COV 检测有效性OD阴性对照0.10， OD阳性对照1.0OD空白对照0.04（双波长检测）1.准备：试剂盒各组份在37平衡30min；2.配洗涤液：用纯化水按1:25将浓缩洗液稀释；3.加样品：每孔加50ul，同时设阳性对照、阴性对照和空白对照（不加样品）；4.加酶结合物：每孔50ul（空白对照不加）；5.孵育：贴上封膜，37 反应30min；表面抗体检测(

4、夹心法)6.洗板：洗板机5次，每次洗液在孔中滞留时间10-15s，并注满反应微孔；7.显色：先加显色液A 50ul，再加入显色液B 50ul，贴上封膜，37反应15min(避光)；（注：显色从加入第一滴显色液B开始计时）8.终止：加终止液50ul；9.判读：终止反应后10min内完成。(450nm处测定吸光度)结果判断及解释 COV=2.1 OD阴性对照（ OD阴性对照低于0.05按0.05计算）阳性：OD样品COV 阴性：OD样品COV 检测有效性OD阴性对照0.10，OD阳性对照1.0OD空白对照0.015（双波长检测）1.准备：试剂盒各组份在37平衡30min；2.配洗涤液：用纯化水按1

5、:25将浓缩洗液稀释；3.加样品：每孔50ul，同时设阳性对照、阴性对照和空白对照（不加样品）；4.加酶结合物：每孔50ul（空白对照不加）；5.孵育：贴上封膜，37 反应30min；e抗原检测(夹心法)6.洗板：洗板机5次，每次洗液在孔中滞留时间10-15s，并注满反应微孔；7.显色：先加显色液A50ul，再加入显色液B50ul，贴上封膜，37反应15min(避光)；（注：显色从加入第一滴显色液B开始计时）8.终止：加终止液50ul；9.判读：终止反应后10min内完成。(450nm处测定吸光度)。结果判断及解释 COV=2.1 OD阴性对照（ OD阴性对照低于0.05按0.05计算）阳性：

6、OD样品COV 阴性：OD样品COV 检测有效性OD阴性对照0.10，OD阳性对照1.0OD空白对照0.015（双波长检测）e抗体检测(竞争抑制法)1.准备：试剂盒各组份在37平衡30min；2.配洗涤液：用纯化水按1:25将浓缩洗液稀释；3.加样品：每孔50ul，同时设阳性对照、阴性对照和空白对照（不加样品）；4.加酶结合物：每孔50ul（空白对照不加）；5.孵育：贴上封膜，37 反应30min；6.显色：先加显色液A 50ul，再加入显色液B 50ul，贴上封膜，37反应15min(避光)；（注：显色从加入第一滴显色液B开始计时）7.终止：加终止液50ul；8.判读：终止反应后10min内

7、完成。(450nm处测定吸光度)结果判断及解释 COV=0.5 （OD阳性对照+OD阴性对照）阳性：OD样品COV 阴性：OD样品COV 检测有效性OD阴性对照1.0，OD阳性对照0.05OD空白对照0.015（双波长检测）c抗体检测(竞争抑制法)1.准备：试剂盒各组份在37平衡30min；2.配洗涤液：用纯化水按1:25将浓缩洗液稀释；3.加样品：每孔加50ul（1:30稀释样本），同时设阳性对照、阴性对照和空白对照（不加样品）；4.加酶结合物：每孔50ul（空白对照不加）；5.孵育：贴上封膜，37 反应30min；6.显色：先加显色液A 50ul，再加入显色液B 50ul，贴上封膜，37反

8、应15min(避光)；（注：显色从加入第一滴显色液B开始计时）7.终止：加终止液50ul；8.判读：终止反应后10min内完成。(450nm处测定吸光度)结果判断及解释 COV=0.5 （OD阳性对照+OD阴性对照）阳性：OD样品COV 阴性：OD样品COV 检测有效性OD阴性对照1.0，OD阳性对照0.05OD空白对照0.015（双波长检测）1.不同品种及批号试剂组份请勿混用；2.试剂从2-8条件下取出，先在室温平衡1h；3.最好用微量移液器加各种组份；4.每次手工加样，应更换吸头；5.加样时尽量避免反应微孔中产生气泡；6.封板膜不能重复使用；【注意事项】7.洗液如有结晶形成建议放置37充分溶解，再稀释； 8.洗板：(洗板机)1)每次使用前、后用蒸馏水或去离子水冲洗，以防止管路堵塞和腐蚀；2)加液量不能过多溢出，但又能充满整个反应微板(350ul);3)一般洗板次数不应少于5次；4)最好采用有底部冲洗和两点冲洗的程序。