基因工程制胰岛素(生工版)
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1、2022-5-30用基因工程方法用基因工程方法获得胰岛素获得胰岛素第四组12022-5-30胰岛素是由胰岛B细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的一种蛋白质激素。胰岛素是机体内唯一降低血糖的激素，同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成。外源性胰岛素主要用来糖尿病治疗。胰岛素这类活性蛋白多肽和细胞因子具有高度生物活性，分子量很大，立体结构异常复杂，体外难以人工合成。所以过去糖尿病患者只能服用从牛、猪体中提取的胰岛素来治疗；但牛、猪胰岛素结构上与人胰岛素有差别，如与猪胰岛素B链第30个氨基酸残基不同，长期服用会引起肾和眼的疾病，故必需要用基因工程方法获得重组人胰岛
2、素进行治疗。22022-5-303基因工程制胰岛素三种方法一、A链和B链分别表达法化学合成A链和B链的编码序列2022-5-304基因工程制胰岛素三种方法一、A链和B链分别表达法表达产物的后期处理路线：2022-5-305基因工程制胰岛素三种方法二、人胰岛素原表达法基因工程菌的构建战略：2022-5-306基因工程制胰岛素三种方法二、人胰岛素原表达法表达产物的后期处理路线：2022-5-307基因工程制胰岛素三种方法三、A链和B链同时表达法2022-5-308方法一： 由于A链和B链上共存在六个半胱氨酸残基，体外二硫键的正确配对率较低，通常只有10% - 20%，因此成本高。方法二： 胰岛素原
3、能形成良好的空间构象，三对二硫键的正确配对率提高，折叠率高。工艺路线依然繁琐。方法三： 需体外折叠。基因工程制胰岛素三种方法三种方法比较：2022-5-30基因工程获取胰岛素的步骤基因工程获取胰岛素的步骤一、获取外源目的基因片段二、选择与获取表达载体三、重组目的DNA片段与表达载体四、选择与获取表达细胞五、重组体导入表达细胞六、对重组体细胞进行筛选纯化鉴定七、工程菌产物鉴定和保存八、发酵培养92022-5-30一、获取外源目的基因片段1选择实验材料2提取RNA，分离RNA3逆转录mRNA,得cDNA第一链4得双链DNA5DNA序列纠错6. 目的基因通过细胞克隆扩增7. 目的基因回收及DNA测序
4、，最终目的基因获取102022-5-30一、获取外源目的基因片段1选择实验材料胰岛素是一种蛋白质类激素，体内胰岛素是胰岛B细胞（即胰岛细胞）受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的。胰岛素基因只有在胰岛B细胞中才能转录出信使RNA，所以用基因工程方法生产胰岛素时，选用胰岛B细胞为获取目的基因的实验材料。112022-5-30一、获取外源目的基因片段2提取RNA，分离RNA 21 总RNA的提取 22 mRNA的纯化 23 mRNA的保存122022-5-30一、获取外源目的基因片段21 总RNA的提取 总RNA的抽提方法有多种，TRIzol试剂是使用组广泛的
5、RNA抽提试剂，主要由苯酚和异硫氰酸胍组成，可以迅速破坏细胞结构，使存在于细胞质及核内的RNA释放出来，并使核糖体蛋白与RNA分子分离。苯酚虽可有效地变性蛋白质，但不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中还加入了8羟基喹啉、异硫氰酸胍、-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase（RNA酶）。TRIzol是从细胞和组织中提取总RNA的即用型试剂，在样品裂解或匀浆过程中，TRIzol能保持RNA完整性。提取RNA时，首先用液氮研磨材料，匀浆，加入TRIzol试剂，进一步破碎细胞并溶解细胞成分。然后加入氯仿抽提，离心，分离水相和有机相，收集含有RNA的水相，通过异丙醇沉淀，可获得比较纯的总RNA，用
6、于下一步mRNA的纯化。132022-5-30一、获取外源目的基因片段211 TRIzol法提取流程（1）样品处理 培养细胞：收获细胞1-5*107，移入1.5ml离心管中，加入1ml TRIzol，混匀，室温静置5min。 组织：取50-100mg组织（新鲜或-70及液氮中保存的组织均可）置1.5ml离心管中，加入1ml TRIzol充分匀浆，室温静置5min。（2）加入0.2ml氯仿，振荡15s，静置2min。（3）4离心，12000g*15min，取上清液。（4）加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min。（5）4离心，12000g*10min，弃上清液。（6）加入1m
7、l 75%乙醇，轻轻洗涤沉淀。4，7500g*5min，弃上清液。（7）晾干，加入适量的DEPCH2O溶解（65促溶10-15min）。142022-5-30一、获取外源目的基因片段211 TRIzol法提取流程图152022-5-30一、获取外源目的基因片段22 mRNA的纯化该方法利用mRNA 3端含有PolyA（多聚腺苷酸）的特点，当RNA流经寡聚dT纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下，mRNA被特异性的结合在柱上，再用低盐溶液或蒸馏水洗脱mRNA。经过两次寡聚纤维柱后可得到较高纯度的mRNA。162022-5-30一、获取外源目的基因片段2 22 21 1 寡聚（寡聚（dTdT）纤维素柱
8、纯化）纤维素柱纯化mRNAmRNA（1 1）试剂准备：）试剂准备： 3M3M醋酸钠（醋酸钠（pH5.2pH5.2）；）； 0.1M NaOH0.1M NaOH； 上样缓冲液：上样缓冲液：20mM Tris-HCl20mM Tris-HCl（pH7.6pH7.6）,0.5M NaCl,1M ,0.5M NaCl,1M EDTA (pH8.0),0.1%SLS(EDTA (pH8.0),0.1%SLS(十二烷基氨酸钠十二烷基氨酸钠) )。配制时可先配制。配制时可先配制Tris-HClTris-HCl（pH7.6pH7.6）、）、NaClNaCl、EDTAEDTA（pH8.0pH8.0）的母液，经高
9、压）的母液，经高压消毒后按各成分确切含量，经混合后再高压消毒，冷却至消毒后按各成分确切含量，经混合后再高压消毒，冷却至6565，加入经，加入经6565温育（温育（30min30min）的）的10%SLS10%SLS至终浓度为至终浓度为0.1%0.1%； 洗脱缓冲液：洗脱缓冲液：10mM Tris-HCl10mM Tris-HCl（pH7.6pH7.6），），1mM EDTA1mM EDTA（pH8.0pH8.0），），0.05%SDS0.05%SDS； 无水乙醇、无水乙醇、70%70%乙醇；乙醇； DEPCDEPC（0.1%0.1%焦炭酸二乙酯）焦炭酸二乙酯） 172022-5-30一、获取外
10、源目的基因片段221 寡聚（dT）纤维素柱纯化mRNA（2 2）操作步骤：）操作步骤： 将将0.5-1.0g0.5-1.0g寡聚（寡聚（dTdT）纤维悬浮于）纤维悬浮于0.1M0.1M的的NaOHNaOH溶液中。溶液中。 用用DEPCDEPC处理的处理的1ml 1ml 注射器或适当的细管，将寡聚（注射器或适当的细管，将寡聚（dTdT）纤维素装柱）纤维素装柱0.5-1ml0.5-1ml，用，用3 3倍柱床体积的倍柱床体积的DEPCH2ODEPCH2O洗柱。洗柱。 使用使用1 1* *上样缓冲液洗柱，直至洗出液上样缓冲液洗柱，直至洗出液pHpH值小于值小于8.08.0。 将将RNARNA溶解于溶解
11、于DEPCH2ODEPCH2O中，在中，在6565中温育中温育10min10min左右，冷却至室温后加入等体左右，冷却至室温后加入等体2 2* *上样上样缓冲液，混匀后上柱，立即收集流出液。当缓冲液，混匀后上柱，立即收集流出液。当RNARNA上样液全部进入柱床后，再用上样液全部进入柱床后，再用1 1* *上样上样缓冲液洗柱，继续收集流出液。缓冲液洗柱，继续收集流出液。 将所有流出液于将所有流出液于6565加热加热5min5min，冷却至室温后再次上柱，收集流出液。，冷却至室温后再次上柱，收集流出液。 用用5-105-10倍柱床体积的倍柱床体积的1 1* *上样缓冲液洗柱，每管上样缓冲液洗柱，每
