微生物限度检查法

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1、1微生物限度检查法概述2我国药品微生物限度标准的发展情况3我国药品微生物限度检验方法的发展情况4微生物限度检查法所需的材料5微生物限度检查试验用物品的准备6无菌室技术要求7细菌、霉菌与酵母菌的检查方法供试品的抽样、保存及检验量试验操作前的准备供试液的制备对照用菌液的制备 菌数测定阴性对照试验细菌、霉菌（酵母菌）检验程序供试液的稀释（10倍递增稀释法）注平皿倾注培养基培养菌落计数菌数报告规则注意事项8.细菌、霉菌（酵母菌）的其他检查方法管稀释法（试管法、MPN法） 滤膜法 计数板法 仪器法 平板涂布法表面涂抹平板法 滤膜培养法酵母菌镜检计数法9. 大肠杆菌检查法概述、原理 检验程序 增菌培养 分

2、离培养 纯培养、革兰染色、镜检生化试验（IMViC）实验中的注意事项10沙门菌检查法11铜绿假单胞菌检查法12金黄色葡萄球菌检查法13破伤风梭菌检查法14活螨检查法15结果判断1微生物限度检查法的意义 药品是防病治病、关系用药者生命健康的特殊商品，必须保证其质量，用药的安全与有效。微生物污染药品引起的药源性疾病屡见不鲜，在国内外均有报道。为保证药品质量，必须对微生物污染进行必要的控制和检验。其意义在于：已有许多实例表明，药品污染微生物不仅危及病人用药安全，而且也直接影响药品的有效性，所以药品卫生质量是药品质量不可分割的部分。反映药品生产工艺的科学性、合理性及质量管理水平。通过检验，凡工艺条件、

3、生产管理水平、生产人员的素质差，不注意文明生产的单位和企业，其生产的药品，染菌必然严重，不合格率无疑就高。微生物限度的检验是提供药品卫生质量状况的重要依据，因而保证销售与使用过程中药品的有效性与安全性，是促进与提高生产单位全面质量管理水平与提高药品质量的重要依据。 2微生物限度检查的范围 根据药品使用的要求，可划分为两大类：规定灭菌的药品：包括注射剂和输液剂，及用于体腔、严重烧伤、溃疡、出血及眼科用药等制剂。非规定灭菌药品：包括常用的口服制剂与一般外用制剂。对这一部分制剂一般不要求绝对无菌，允许一定限量的微生物存在，但同时规定不得有可疑致病的细菌存在。由于致病菌的范围很广，各国药典都规定了几个

4、常见的致病菌或指标菌作为控制菌。在非规定灭菌的制剂中，对每克或每毫升的药品按剂型或品种不同规定：染菌量检查：包括细菌数、霉菌数及酵母菌数测定，以检查这几类微生物对药品的污染程度。控制菌检查：包括大肠埃希菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌及铜绿假单胞菌的检查等。3药品微生物限度检查抽样量与检验量药品微生物限度检验中的困难，最根本的原因在于检验对象本身的特殊性。药品微生物限度检验对象的特性：不确定性：药品受外来微生物的污染，这种污染是可无可有；在有中又可多可少；其种类可以多样。污染的情况可依生产、设备、原材料、管理、剂型等条件而定，非药品本身所固有。所以微生物限度检查的对象是不确定的。药品所规定的检查项目

5、，除无菌检查、热原检查具有上述性质，其他项均无此特征。这一点往往被忽视。污染对药品而言是一个意外事件。污染批号中的不合格品是一个随机变量。分布的不均匀性：不均匀性是不确定性的另一种表现形式，在一个批号内产品有的被污染，有的不被污染，分布不匀；在被污染的部分中有的数量极多，有的较少，种类上可以复杂或较单一。这种不均匀性源于污染源的复杂性；原辅料 污染、工艺污染、空间污染和操作人员污染等等构成污染量的多少差异，形成不均态。再者，微生物具有簇团性；簇团大小、紧密程度是可遗传的，簇团的分散性差异极大，该特点无疑强化了不均匀性。活体特征：药典中以活的微生物作为检验对象也是独特特性。由于以上特殊性，抽样对

6、微生物限度检测值将产生很大的影响。当药品无污染时，抽样将不影响检验，当批产品存在污染品时，抽样的样本是随机变量，抽样的影响如下：抽样方法：不同的抽样方法对批产品总体的代表性是不同的，测定值也是有差异的。如抽取可疑样品与随机抽样，其检出率与数字显然前者大于后者。抽样量：抽样量的多少，对样本的代表性极为重要，如含10不合格率的批产品，从中抽取2件数为样本进行控制菌检验时，有81机率判定为合格品，而抽取30件数时，会有96机率判定为不合格品。以上表明抽样方法、抽样数量、抽样次数均影响测定结果。以控制菌检验为例，决定染菌检出与否必须具备两个条件：（A）样品是否是含染菌的样品；（B）检验操作正确无误，其

7、中（A）是前提条件。 中国药典2000年版关于抽验方法与抽样数量规定：供试品为随机抽样，一般抽样量为检验用量（两个以上最小包装单位）的3倍量。对异常的供试品应针对性的抽样，对外观可疑污染或对有争议复验的样品应抽取可以污染和有争议复验的原样品。对异常的供试品应针对性的抽样，对外观可疑污染或对有争议复验的样品应抽取可以污染和有争议复验的原样品。凡能从药品、瓶（外盖内侧及瓶口周围）外观看出发霉、生虫以及变质的药品不必再继续检验，应直接判为不合格。不能以有时外观有上述情况而检验内容为合格，来判定该药品合格，因为瓶口染菌，对服用者是不安全的，如自瓶口直接服药时，所染菌随之进入人体，同时发现瓶口一旦染菌，

8、瓶内药液最终要受到污染。检验量与抽样量是两种不同范畴的量，后者指从全批产品（或抽样全过程）抽取的单位包装，前者是指检验用量，一般抽样量大于检验量。检验量只是抽样量各包装的混合样品的一部分。中国药典2000年版规定检验量为每次最少应分取两瓶（盒）以上的样品共10克或10毫升，中药蜜丸至少应分取4丸以上共10克。 目前我国以1克或1毫升、膜剂以10cm2作为报告单位；英美药典及欧洲药典也是以1克或1毫升作为限量，但控制菌有的是以10克或10毫升作为限量，比我国的限量规定严格。总之，抽样量和检验量大小对检验结果影响较大（尽管目前抽样方案还存在不科学，漏检率高）。由于药品微生物检验是破坏性检验，检验1

9、瓶（盒）会破坏1瓶（盒），检验量愈大，则破坏性愈大，尤其对贵重药品，生产单位、经营单位损失也就越大。因此，如何确定适宜的既能满足抽样检验基本要求，又能使生产、经营者可接受的抽样方案，是目前需要解决的问题。但目前的规定必须遵循，不能随意变动，尤其不能减少（除对贵重、微量包装的药品可酌情减少检验量除外）。 11980年我国药品微生物限度检验工作正式发行药品卫生检验方法。21984年出版第二版药品卫生检验方法。31990.12年中检所出版第三版，主要对原方法中各地反映意见较多的问题进行了改写；增加了部分检验方法和供试液的制备方法；为了同国内外检验方法相协调，对某些内容作了相应的更改，此外，还参照国家

10、标准的编写格式作了编排。41990年版药典第二增补本收载了微生物限度检查法。这也是我国首次在药典上收载此方法。51995年版药典也收载了此检查法，少数剂型收载了限度规定。（20个化学药品规定限度）。6、2000年版药典一、二部同时收载了检查法和限度标准。首次把 微生物限度检查法和限度标准同时发布。 11972年开展此项工作21978年颁布我国第一个“药品卫生标准”31986年颁布修改后的“药品卫生标准”，1987年12月1日起供内部执行41989年下达“药品卫生标准补充规定和说明”51990年版药典第二增补本收载了20个化学药品种的微生物限度标准规定，与国际惯例一致61995年版药典少数几个剂

11、型（滴眼剂等）收载了微生物限度。规定按微生物限度检查法检查不得有菌生长72000年版药典按剂型、中西药分类规定微生物限度，还对几个生化药品在各论中项下作了具体规定 营养琼脂培养基 玫瑰红钠琼脂培养基酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基（YPD） 胆盐乳糖培养基（BL） 4甲基伞形酮葡糖苷酸蛋白胨培养基（MUG）乳糖培养基 5乳糖培养基蛋白胨水培养基 磷酸盐葡萄糖胨水培养基枸橼酸盐培养基 曙红亚甲蓝琼脂（EMB）麦康凯琼脂（MacC） 营养肉汤恒温培养箱 3035 361 霉菌培养箱 2528恒温水浴箱 451 净化工作台 生物显微镜 1500X体视显微镜或放大镜 电冰箱电热干燥箱 250300 高压蒸