菌种退化与保藏

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1、第8章菌种退化与保藏n第一节菌种的退化与防止第一节菌种的退化与防止n一、菌种退化一、菌种退化(degeneration)n生产菌种或优良菌种由于传代或保藏之后，生产菌种或优良菌种由于传代或保藏之后，群体中的某些生理特性或形态特征减退或群体中的某些生理特性或形态特征减退或消失。消失。二、菌种退化的原因n1、基因突变是主要原因n2、连续传代是加速退化的直接原因n3、培养条件和保藏条件有多方面的影响n(1)不同环境条件n(2)培养基n(3)培养条件n(4)保藏条件三、菌种退化的防止n1、减少传代n2、用单核细胞和单菌落传代n3、经常进行菌种纯化n4、采用良好的培养基和培养条件n5、科学的保藏方法四、

2、菌种复壮n1、菌种复壮：通过自然分离的方法将那些尚未弃衰退的细胞从群体中分离出来，使菌种的优良性壮得以恢复。是一种消极的措施。n2、积极措施：在尚未退化前，经常进行自然分离。第二节第二节 工业微生物菌种保藏技术工业微生物菌种保藏技术n 在生产发酵中，具有高产有重要经济价在生产发酵中，具有高产有重要经济价值的某一期待代谢产物主能力的微生物值的某一期待代谢产物主能力的微生物菌种的保存和长期保藏，对于一成功的菌种的保存和长期保藏，对于一成功的工业发酵过程极为重要。工业发酵过程极为重要。一、保藏方法应具备的条件一、保藏方法应具备的条件(1)经长期保藏后菌种存活健在；经长期保藏后菌种存活健在；(2)保证

3、高产突变株不改变表型和基因型，保证高产突变株不改变表型和基因型，特别是不改变初级代谢产物和次级代谢产物特别是不改变初级代谢产物和次级代谢产物生产的高产能力。生产的高产能力。(3)菌种保藏的基本措施是低温、干燥、真空。菌种保藏的基本措施是低温、干燥、真空。二、工业微生物菌种保藏技术二、工业微生物菌种保藏技术 (1)冷冻干燥或真空干燥保藏；冷冻干燥或真空干燥保藏；(2)超低温或在液氮中冷冻保藏；超低温或在液氮中冷冻保藏；(3)转接培养或斜面传代保藏；转接培养或斜面传代保藏；(4)土壤或陶瓷珠等载体干燥保藏。土壤或陶瓷珠等载体干燥保藏。2.12.1 冷冻保藏冷冻保藏 n冷冻保藏为保藏微生物菌种的最简

4、单而有效的冷冻保藏为保藏微生物菌种的最简单而有效的方法。方法。n通过冷冻，使微生物代谢活动停止。一般而言，通过冷冻，使微生物代谢活动停止。一般而言，冷冻温度愈低，效果愈好。为了获得满意的冷冷冻温度愈低，效果愈好。为了获得满意的冷冻结果，通常应在培养物中加入一定的冷冻保冻结果，通常应在培养物中加入一定的冷冻保护剂。冷冻保藏时温度要求在护剂。冷冻保藏时温度要求在-20以下，同时以下，同时应认真掌握好冷冻速度和解冻速变。应认真掌握好冷冻速度和解冻速变。n冷冻深藏的缺点之一是培养物运输较困难。冷冻深藏的缺点之一是培养物运输较困难。冷冻保藏种类冷冻保藏种类 1、普通冷冻保藏技术、普通冷冻保藏技术(-20

5、)2、超低温冷冻保藏技术、超低温冷冻保藏技术(-60一一-80)3 3、液氮冷冻保藏技术、液氮冷冻保藏技术1 1、普通冷冻保藏技术、普通冷冻保藏技术(-20)(-20)n将液体培养物或从琼脂斜面培养物收获的细胞分接将液体培养物或从琼脂斜面培养物收获的细胞分接到试管或指管内，然后贮藏于冰箱的冷藏室中，或到试管或指管内，然后贮藏于冰箱的冷藏室中，或于温度范围在于温度范围在-5-5-20-20的普通冰箱的普通冰箱(-20)(-20)中。或中。或者，将菌种培养在小的试管或培养瓶斜面上，待生者，将菌种培养在小的试管或培养瓶斜面上，待生长适度后，将试管或瓶口用橡胶塞严格封好，同上长适度后，将试管或瓶口用橡

6、胶塞严格封好，同上置于冰箱中保存。置于冰箱中保存。n用此方法可以维持若干微生物的活力用此方法可以维持若干微生物的活力1 12 2年。年。注意！注意！n应注意的是经过一次解冻的菌株培养物不宜再应注意的是经过一次解冻的菌株培养物不宜再用来保藏。用来保藏。n保藏过程中应注意控制保藏温度，培养瓶或试保藏过程中应注意控制保藏温度，培养瓶或试管应严格密封。管应严格密封。n这一方法虽简便易行，但不适宜多数微生物的这一方法虽简便易行，但不适宜多数微生物的长期保藏。长期保藏。2 2、超低温冷冻保藏技术、超低温冷冻保藏技术 (-60(-60至至-80)-80)n要求长期保藏的微生物菌种，一般都要求在要求长期保藏的

7、微生物菌种，一般都要求在-60以下进行保藏。以下进行保藏。n在超低温冷藏柜中保藏菌种的一般方法：在超低温冷藏柜中保藏菌种的一般方法：n1离心收获对数生长中期至后期的微生物细胞；离心收获对数生长中期至后期的微生物细胞；n2用新鲜培养基重新悬浮所收获的细胞；用新鲜培养基重新悬浮所收获的细胞；n3加入等体积的加入等体积的20甘油或甘油或10二甲亚砜；二甲亚砜；n4混匀后分装入冷冻指管或安瓿中，于混匀后分装入冷冻指管或安瓿中，于-70超低温冰箱中保藏。超低温冰箱中保藏。n n如果待保藏菌种生长在斜面上，则可用如果待保藏菌种生长在斜面上，则可用含含1010甘油的新配制液体培养基洗涤收甘油的新配制液体培养

8、基洗涤收获。超低温冰箱的冷冻速度一般控制在获。超低温冰箱的冷冻速度一般控制在1-21-2minmin。干细菌和真菌菌种可通过。干细菌和真菌菌种可通过此保藏方法保藏此保藏方法保藏5 5年而活力不受影响。年而活力不受影响。3 3、液氮冷冻保藏技术、液氮冷冻保藏技术 (1)冷冻保护剂冷冻保护剂在液氮冷冻保藏中，最常用的冷冻保护剂是二在液氮冷冻保藏中，最常用的冷冻保护剂是二甲亚砜和甘油，最终使用浓度一般为甘油甲亚砜和甘油，最终使用浓度一般为甘油10、二甲亚砜二甲亚砜5。所使用的甘油。所使用的甘油般用高压蒸汽灭般用高压蒸汽灭菌，而二甲亚砜最好为过滤灭菌。菌，而二甲亚砜最好为过滤灭菌。 (2)(2)液氮冷

9、冻保藏微生物菌种的步骤液氮冷冻保藏微生物菌种的步骤 1 1待冷冻保藏菌种悬液的制备待冷冻保藏菌种悬液的制备 (1)(1)从生长斜面制备菌悬液：每一斜面加入从生长斜面制备菌悬液：每一斜面加入5ml5ml含含1010甘油的营养液体培养；用巴氏吸管吹吸斜面制甘油的营养液体培养；用巴氏吸管吹吸斜面制成孢子及菌体细胞悬液；成孢子及菌体细胞悬液；0.50.5lmllml分装玻璃安瓿或分装玻璃安瓿或液氮冷藏专用塑料瓶。液氮冷藏专用塑料瓶。 (2)(2)从浸没培养物制备菌悬液：从浸没培养物制备菌悬液： 在浸没培养液中加入等体积在浸没培养液中加入等体积20%20%无菌甘油；无菌甘油；轻轻振荡混匀培养液，如果菌体

10、絮凝较紧，则轻轻振荡混匀培养液，如果菌体絮凝较紧，则需先用玻璃珠打散；需先用玻璃珠打散；0.5-lml0.5-lml分装玻璃安瓿或液分装玻璃安瓿或液氮冷藏专用塑料瓶，玻璃安瓿用酒精喷灯封口；氮冷藏专用塑料瓶，玻璃安瓿用酒精喷灯封口；将所有封好的安瓿置于将所有封好的安瓿置于55冰箱中冰箱中3min3min，以使细，以使细胞和悬浮培养基之间达到平衡。胞和悬浮培养基之间达到平衡。(1)(1)将安瓿或液氮瓶置于铝盒或布袋中，然后置于将安瓿或液氮瓶置于铝盒或布袋中，然后置于一较大的金属容器中；一较大的金属容器中；(2)(2)将此金属容器置于控速冷冻机的冷冻室中；将此金属容器置于控速冷冻机的冷冻室中；(3

11、)(3)以以1-2/min1-2/min的致冷速度降温，直到温度达到相的致冷速度降温，直到温度达到相对温度之上几度的细胞冻结点对温度之上几度的细胞冻结点( (通常为通常为-30)-30)；(4)(4)补加一定量的液氮至系统中，使细胞在冻结点补加一定量的液氮至系统中，使细胞在冻结点时尽可能快地发生相变；时尽可能快地发生相变； 2 2控速冷冻控速冷冻 (5)(5)细胞冻结后，将致冷速度降为细胞冻结后，将致冷速度降为1/min1/min，直，直到温度达到温度达-50-50；(6)(6)将安瓿迅速移入液氮罐中于液相将安瓿迅速移入液氮罐中于液相(-)96)(-)96)或气相或气相(-156)(-156)